Depuis 2021, les États membres de l’Union européenne doivent publier sous un format standardisé les résumés non techniques (RNT) des projets d’expérimentation animale autorisés sur leur territoire. Le système européen ALURES est exclusivement en anglais et ne permet pas de filtrer par degré de gravité ou devenir des animaux après les expériences. Je regroupe donc régulièrement ici les RNT français pour en faciliter l’exploration et la compréhension d’ensemble.
Dernière mise à jour : 02/01/2025
RNT (FR) 2013-2021
Jusqu’en 2021, le ministère de la Recherche publiait sur son site web des résumés très succincts des projets approuvés par ses soins, compilés dans des fichiers PDF peu maniables. Regroupés par année, ces fichiers sont téléchargeables ci-dessous.
Résumés des projets approuvés depuis 2022
Légende
Souffrances : sans réveil (▲), légères (▲), modérées (▲), sévères (▲).
Devenir prévisionnel des animaux : adoption (), élevage (), réutilisation (), non précisé ().
Rôle de facteurs sécrétés ou intracellulaires dans l’immunogénicité des chimiothérapies anticancéreuses chez la souris
Choix de l'espèce
Le choix d'utiliser la souris dans cette étude repose sur plusieurs raisons. Tout d'abord, la souris est un modèle complet et fonctionnel, offrant des similitudes intéressantes avec le système immunitaire humain, ce qui en fait un modèle utile pour cette recherche. De plus, nous connaissons bien sa génétique, ce qui facilite les études moléculaires et génétiques. Nous disposons d'installations adaptées pour ces animaux, d’une solide expertise dans les techniques d'expérimentation animale ainsi que dans le suivi vétérinaire et microbiologique. Nous utilisons des souris adultes âgées à partir de 7 semaines, car elles possèdent un organisme avec un développement complet et un système immunitaire fonctionnel.
procédures
Une première partie des animaux subira une expérience de vaccination antitumorale qui impliquera 2 injections sous cutanées sous anesthésie gazeuse (3 min /souris/injection). Une seconde partie des animaux sera soumise à une expérience de croissance tumorale qui impliquera 1 injection sous cutanée sous anesthésie gazeuse (3 min /souris/injection) et 1 injection intrapéritonéale (animal vigile, 2 min/souris/injection). Une 3éme partie des souris sera soumise à une expérience de croissance tumorale qui impliquera 1 injection sous cutanée sous anesthésie gazeuse (3 min /souris/injection), 1 injection intrapéritonéale (animal vigile, 2 min/souris/injection), 4 injections intratumorales sous anesthésie gazeuse (2 min/souris/injection). La dernière partie des animaux sera soumise à une expérience de croissance tumorale qui impliquera 1 injection sous cutanée sous anesthésie gazeuse (3 min /souris/injection), 5 injections intrapéritonéales (animal vigile, 2 min/souris/injection). Tous les animaux seront manipulés brièvement (moins d’1 min) tous les 2-3 jours pour mesurer les tumeurs.
Impact sur les animaux
Certains effets indésirables peuvent être observés chez la souris lors des expérimentations, notamment la manipulation et la contention régulière peuvent leur engendrer un certain stress. De plus, lors des injections une légère douleur (équivalente à une piqure) peut survenir, éventuellement accompagnée d’une irritation au niveau du site d’injection. Les sites d’injections peuvent s’infecter. L’anesthésie peut induire un stress thermique. Par ailleurs, la croissance tumorale et l’administration de traitements peuvent entrainer une baisse ou perte d’appétit qui peut causer une perte de poids des animaux.
Tous les animaux à la fin des procédures seront euthanasiés. Chaque procédure requiert l’injection de cellules tumorales, ce qui implique l’impossibilité de garder les souris en vie à la fin de l’expérience. De plus, des analyses seront effectuées sur tissus et organes post-mortem.
Objectifs
La chimiothérapie demeure aujourd’hui le traitement de référence pour la majorité des cancers. Un nombre limité d’agents tels que les anthracyclines ou encore l’oxaliplatine ont la capacité de déclencher des signaux de stress pre-mortem qui induisent la mort cellulaire immunogène (ICD, de l’anglais « Immunogenic cell death »). Cette dernière permet la stimulation d’une réponse immunitaire antitumorale, tout en conférant une protection à long terme. Nous avons effectué une étude de criblage multi-omique in vitro qui nous a permis d’identifier des gènes associés à l’ICD, en particulier des gènes codant pour des cytokines et chimiokines. L’objectif de ce projet est de confirmer in vivo l’implication de ces gènes et de leurs voies de signalisation dans l’ICD et plus globalement dans l’immunité antitumorale et leur contribution à l’efficacité thérapeutique. Ce projet permettra de mieux comprendre les mécanismes par lesquels les chimiothérapies stimulent l’immunité antitumorale et identifiera de nouvelles cibles thérapeutiques.
Bénéfices attendus
Les molécules qui induisent la mort cellulaire immunogène sont très utilisées en clinique pour le traitement des cancers (anthracyclines, oxaliplatine, cyclophospamide, etc). Les expérimentations précliniques prévues visent à confirmer les effets antitumoraux des nouvelles cibles thérapeutiques identifiées in vitro et à approfondir notre compréhension des effets antitumoraux du système immunitaire. Ces études permettront d’explorer plus en profondeur les mécanismes sous-jacents à ce processus. De plus, nous pourrons évaluer si les voies de signalisations identifiées présentent également des propriétés immunogènes afin d’ouvrir le développement de nouvelles approches thérapeutiques pour l’immunothérapie anti-cancéreuse. Ces travaux permettront d’une part d’induire l’immunogénicité dans le cadre de traitements non inducteurs de mort immunogène et d’autre part d’améliorer l’efficacité des molécules inductrices de ce type de mort cellulaire.
Remplacement
Nous avons effectué une étude de criblage à haut débit in vitro qui nous a permis d’identifier des gènes associés à l’implication du système immunitaire dans la morte cellulaire des cellules cancéreuses. Nous souhaitions valider ces data in vivo, car il n’y a pas de modèles alternatifs permettant d’étudier l’efficacité des traitements anticancéreux et de confirmer leur action via l’activation du système immunitaire. Il est donc essentiel d’utiliser un model reproduisant au mieux l’environnement tumoral et le fonctionnement du système immunitaire. Cela se traduit par la nécessité d’utiliser un organisme entier dans lequel les cellules et les composants du système immunitaire peuvent circuler, permettant ainsi une représentation plus fidèle des interactions biologiques complexes à l’intérieur du corps.
Réduction
Pour la réalisation de cette étude, nous utiliserons un maximum de 9132 animaux sur 5 ans. Des groupes de 15 souris seront utilisés afin de garantir une évaluation statistique robuste des effets analysés. Nous appliquerons des tests statistiques pour comparer l’effet étudié entre les groupes, pour suivre la croissance tumorale et la survie des animaux. Dans un souci de Réduction du nombre des animaux contrôles, nous chercherons à regrouper les expérimentations lors que cela est possible. L’étude sera interrompue si les expériences initiales ne confirment pas l’hypothèse de travail. Plusieurs tissus seront prélevés et soumis à diverses analyses (immunologiques, histologiques ou de biologie cellulaire et moléculaire) pour extraire le maximum de données de chaque procédure.
Raffinement
Les souris seront soumises à un suivi quotidien afin d’évaluer leur niveau de stress. Pour minimiser leur stress, les souris seront logées ensemble (un maximum de 5 souris par cage), offrant un environnement social, au calme et un espace vital suffisant. Les conditions d’hébergement respecteront les normes conventionnelles et les animaux auront accès en permanence à l’alimentation et à l’eau. Un milieu enrichi adapté est prévu : dans les cages il y aura des nids et des tunnels en carton. Le comportement général des animaux sera surveillé régulièrement et leur poids sera mesuré avant le début des traitements, ainsi qu’une fois par semaine tout au long de l’expérience de croissance tumorale. Toutes les interventions seront effectuées par des personnes expérimentées et éloignées des animaux hébergés. Les manipulations seront réalisées dans le souci constant de Réduire au maximum l’inconfort et la souffrance des animaux (anesthésie, tapis chauffants...). Les critères définis pour atteindre un point limite seront strictement appliqués, et les souris seront euthanasiées à la fin de l’étude ou en cas d’atteint de ces points limites préétablis.
Immunogénicité d’un vaccin contre Enterococcus chez les poulet(te)s
Choix de l'espèce
Il s'agit de l'espèce cible du vaccin, pertinente afin d'obtenir les données sérologiques recherchées. Les animaux seront vaccinés à partir de 3 semaines d'âge, correspondant à un âge de maturité suffisante pour la production d'anticorps.
procédures
les 2 piqûres pour les injections de vaccin (5 secondes par piqûres) _ les 4 piqûres pour les prises de sang (20 secondes par prise de sang)
Impact sur les animaux
Les nuisances sont : _ le maintien en animalerie _ les 2 piqûres pour les injections de vaccin (5 secondes par piqûre) _ les 4 piqûres pour les prises de sang (20 secondes par prise de sang) _ les réactions locales de type granulome inflammatoire de quelques mm dûes aux adjuvants (réactions classiques aux adjuvants huileux couramment utilisés en médecine vétérinaire)
Les animaux seront euthanasiés à la fin de la procédure. Cette décision est prise considérant le type de souche de poulet(te)s concerné qui est à croissance très rapide (animaux très lourds). Ce sont des animaux sélectionnés pour un élevage à court terme et leur morphologie rend l'adoption inenvisageable.
Objectifs
Etudier la réponse sérologique de poulet(te)s suite à la vaccination par un vaccin inactivé contre Enterococcus cecorum pour confirmer son efficacité à induire une réponse immunitaire satisfaisante pour les utilisateurs. L'interrogation réside dans l'absence de données bibliographiques sur la production d'anticorps à partir de bactérines (bactéries inactivées) du genre Enterococcus, bactéries à Gram positif connues pour être mauvais imunogènes. Il n'existe pas à l'heure actuelle de vaccin sous Autorisation de Mise sur le Marché contre cette bactérie, problématique émergente et devenant majeure en élevage de poulet(te)s de chair en France. Cette bactérie entraîne des troubles locomoteurs allant jusqu'à des poulet(te)s assis, des boîteries, des retards de croissance, de la mortalité, entraînant des pertes économiques importantes. Il y a une forte augmentation des troubles dûs aux enterocoques entre 2006 et 2020 (0,4% portage à 12,9%, dont 53% E. cecorum, déclaration Reseau National Observations Epidémiologiques Aviculture ). Différentes formulations de vaccins seront testées: titres antigéniques et adjuvants différents. Ce sont tous des adjuvants huileux déjà utilisés couramment en Europe dans des autovaccins et/ou vaccins ayant des autorisations de mise sur le marché.
Bénéfices attendus
Il s'agit d'une preuve de concept, permettant de démontrer la production d'anticorps contre Enterococcus cecorum après vaccination des oiseaux et de comparer les différentes formulations testées. Si les résultats sont positifs, d'autres études seront engagées afin de développer un vaccin contre cette pathologie.
Remplacement
Il s'agit ici d'étudier la réponse sérologique des poulet(te)s suite à l'injection du vaccin. Il n'y a pas de méthode alternative permettant d'évaluer la réponse sérologique in vitro.
Réduction
Dans les monographies de la pharmacopée européenne pour les vaccins poulet(te)s, le test d'activité d'un lot se fait par suivi sérologique sur au moins 10 animaux vaccinés et 3 animaux témoins. Dans cette DAP nous souhaitons tester 5 formulations, avec 10 animaux vaccinés par formulation correspondant au minimum de la pharmacopée pour ce type de test, et avoir un groupe témoin de 10 animaux pour assurer d'avoir un effectif suffisant à une bonne évaluation du niveau sérologique initial des animaux non vaccinés (car animaux venant d'un élevage conventionnel pouvant avoir des anticorps contre Enterococcus avant vaccination).
Raffinement
Les poulet(te)s sont logés par groupe ce qui leur permet d'exprimer leur comportement grégaire. Mise à disposition de perchoirs dans chaque logement. Surveillance accrue en cas de détection de souffrance avant l'atteinte de points limites. De la musique est également diffusée (habituation aux voix humaines et aux bruits). Les animaux sont élevés au sol, sur une litière végétale permettant le comportement naturel de grattage et leur permettant également de s'y rouler pour nettoyer leur plumage.
Identifier les gènes responsables de la dégradation ou de la réparation du neurone et du muscle
Choix de l'espèce
Le poisson-zèbre donne accès à de nombreuses procédures non-invasives pour suivre les structures locomotrices chez l’embryon et la larve (à la fois d’un point de vue anatomique et fonctionnel). De plus, le modèle est totalement adapté aux études thérapeutiques, aux suivis microscopiques et aux approches génétiques décrits dans le projet. En outre, l’utilisation du poisson-zèbre, notamment à l’état larvaire, permet de Remplacer l’utilisation de modèles mammifères. Enfin, de par sa transparence et son développement externe, le poisson-zèbre représente un modèle unique pour visualiser ce qui se passe au cœur de nos cellules, pour explorer des processus impossibles à voir chez d'autres modèles. Pour l’étude de l’appareil locomoteur, les animaux seront étudiés entre 24 heures post-fertilisation et 6 jours post-fertilisation. Ceci permet de prendre en compte la totalité du développement de la mandibule et des structures neuromusculaires, et de considérer le temps nécessaire à leur régénération. Pour les gènes présentant une potentielle létalité développementale, le suivi sera prolongé jusqu’à 30 jours, stade auquel la plus part des défauts génétiques conduisent à la mort prématurée de la larve.
procédures
Les larves de 48 et 72heures post-fertilisations seront soumises à des injections cellulaires ou à des lésions des tissus locomoteurs (lésion du cartilage, de la moelle épinière ou de la nageoire caudale). Chaque intervention n'excèdera pas 15 minutes et sera effectuée sous anesthésie totale. Les procédures de lésion pourraient engendrer un défaut de locomotion transitoire qui perdurera de 2 à 3 jours avant réparation des tissus. Etant donnée les capacités régénératrices du poisson-zèbre, une récupération totale est observée entre 5 et 6 jours post-fertilisation. Au stade où la larve acquiert un comportement de chasse et de prise alimentaire, la locomotion de l’animal n’est donc plus altérée. Les différentes interventions seront effectuées sous anesthésie et les larves trop affectées par l’intervention sont mises à mort.
Impact sur les animaux
En mimant certaines pathologies humaines, la suppression ou la surexpression de nos gènes d’intérêt pourrait mener à la diminution de la locomotion de la larve, comme décrit chez les patients. Les différents modèles utilisés dans ce projet (mutants ou transgéniques), ne seront conservés au-delà de 6 jour post-fertilisation que si la prise alimentaire de l’animal n’est pas compromise. Toute apparition de point limite entrainera la mise à mort du poisson. La lésion de la moelle épinière et de la nageoire à 3 jours post-fertilisation pourraient entraîner une Réduction transitoire de la locomotion chez la larve. Ce défaut ne devrait pas dépasser 6 jours post-fertilisation étant donnée les capacités de réparation tissulaire existant chez le poisson-zèbre. La lésion de la mâchoire quant à elle, ne devrait pas affecter la prise alimentaire de la larve au-delà de 6jours post-fertilisation.
Afin de Réduire au maximum le nombre de poissons utilisés dans notre étude, chaque procédure prendra fin avec la mise à mort de l'animal puis le stockage des tissus à -80°c pour des analyses ultérieures. Ceci permettra d'utiliser une même larve pour les procédures in vivo puis pour les analyses histologiques et biochimiques.
Objectifs
Le projet global vise à identifier les zones de notre ADN responsables des maladies génétiques qui contrôlent la locomotion. Nous cherchons notamment à découvrir les mécanismes qui poussent un tissu à dégénérer, ou qui au contraire, permettent sa réparation (c’est-à-dire sa régénération). Pour ce faire, nous supprimerons chez le poisson-zèbre, les gènes qui sont mutés chez des patients atteints de maladies neuromusculaires. Nous observerons alors comment l'absence de ces gènes peut impact les neurones, les muscles et les cartilages du poisson. Objectif 1: Découvrir les zones de l'ADN impliquées dans les maladies du système nerveux et musculaire. Objectif 2: Déterminer l'impact de ces gènes sur les mécanismes de réparation de tissus (régénération). Objectif 3: Tester des molécules potentiellement thérapeutiques sur ces modèles pour identifier de nouveaux traitements.
Bénéfices attendus
Notre projet permettra de mieux comprendre les gènes qui assurent le fonctionnement de nos neurones et de nos muscles, et plus généralement, de l’appareil locomoteur. Notre étude permettra surtout de mettre en avant les processus qui ont lieu au cœur de nos cellules, en regardant les compartiments qui sont à l'intérieur même de nos neurones ou de nos myocytes. Enfin, l'identification de nouveaux agents thérapeutiques permettra de mettre en place de nouveaux traitement pour les maladies qui affectent la capacités des patients à se déplacer.
Remplacement
Afin de décrypter les pathologies qui affectent le système locomoteur, il est important d’utiliser un modèle qui modélise à la fois les systèmes nerveux, musculaires et cartilagineux, tout en reproduisant les interactions complexent qui les lient. Des modèles cellulaires seront utilisés autant que possible dans notre étude, mais nous seront contraints de faire appel à des modèles animaux pour prendre en compte l’appareil locomoteur dans son ensemble. Dans ce cadre, le modèle du Danio rerio représente la meilleure stratégie. L’utilisation de la larve de poisson-zèbre permet de Remplacer l’utilisation de modèles mammifères, en ligne directe avec les recommandations des 3R. La caractérisation des nouveaux modèles de pathologies humaines proposée dans notre étude représente autant de nouveaux outils pour comprendre les désordres génétiques sans recourir aux modèles rongeurs.
Réduction
En travaillant sur le meilleur design possible pour notre étude, nous avons pu faire en sorte que chaque animal participe à plusieurs parties du protocole, via des approches non-invasives. Ainsi, nous pouvons, à partir d’une même larve, assurer le suivi de la morphologie globale de l’animal, l’analyse microscopique de ses tissus, le suivi locomoteur, puis l’étude biochimique après euthanasie des individus. Ceci permet de Réduire drastiquement le nombre de larves utilisées dans le projet global.
Raffinement
Lors de notre étude, chaque procédure sera effectuée sous anesthésie, avant un retour rapide dans les conditions d'élevage. Après chaque intervention, un suivi quotidien des animaux sera effectué tout au long de l’étude. Les nourrissages manuels assurés chaque jour permettront une observation régulière de chaque individu tout au long des procédures pour détecter une altération de la nage ou de la prise alimentaire. La mise en place de points de contrôle et de critères d’arrêt bien définis permettra d’assurer le maintien des animaux dans les meilleures conditions.
Effet d’une immunothérapie cellulaire sur des modèles murins de différentes tumeurs humaines (cancer du sang, cancer des poumons, du foie et du sein).
Choix de l'espèce
L’espèce animale choisie dans ce projet est la souris. Cette espèce présente l’avantage d’être un petit mammifère dont le comportement est bien connu et proche de l’humain. Ainsi, l’évaluation du bien-être et de la douleur liée à l’expérimentation peut être effectuée aisément (perte de poids, posture, aspect du poil, comportement agressif, isolement) permettant une prise en charge rapide et adapté. De plus, les modèles murins de cancers du sang, du poumon, du sein ou encore du foie sont bien décrits dans la littérature scientifique. Les souris utilisées dans ce projet sont des animaux adultes de 2 à 3 mois au début de la procédure (injection des cellules tumorales), les pathologies étudiées se développant chez les individus adultes.
procédures
Notre projet consiste à développer une nouvelle immunothérapie cellulaire « universelle » applicable à différents cancers (cancer du sang, du poumon, du sein, du foie). Pour cela, nous utiliserons plusieurs modèles expérimentaux consistant tous en l’injection de cellules cancéreuses soit par voie intraveineuse (veine de la queue, durée moins d’une minute sur souris éveillée) soit par injection dans la rate ou dans le foie (par chirurgie sous anesthésie et analgésie, durée 15 minutes) dans des souris dépourvues de système immunitaire et préalablement irradiées (cela permet d’augmenter la greffe des cellules cancéreuses et leur multiplication). Après l’établissement de la tumeur (en quelques jours), notre thérapie cellulaire sera injectée (par voie intraveineuse dans la veine de la queue sur souris éveillées ; durée 1 minute). La progression de la tumeur et donc l’efficacité de notre immunothérapie cellulaire seront suivis par imagerie sous anesthésie générale (durée de la session : 15 min) 24h après le début l'injection du traitement puis deux fois par semaine pendant toute la durée de l'étude, soit 4 mois maximum. Afin de compléter l’étude sur l’utilisation de cette population de cellules particulière en thérapie des cancers, nous serons également amenés à traiter un lot de souris avec la molécule connue pour activer nos cellules d’intérêt thérapeutique (administration par injection dans l’abdomen ou dans la veine de la queue au maximum tous les 2 jours, sans anesthésie ; durée de l’injection moins d’une minute). Nous testerons aussi la nécessité d’une 2e voire d’une 3e injection de nos cellules « médicament » pour éradiquer la tumeur. Nous évaluerons également la capacité de nos cellules à rester dans l’organisme et à prévenir une rechute en administrant une seconde dose de cellules tumorales. Chaque semaine, une prise de sang (1 à 2 gouttes prélevées au niveau de la veine de la joue sur souris éveillée) sera effectuée pour suivre la présence des cellules thérapeutiques (durée du prélèvement: 30 s; sur une période de 4 mois maximum).
Impact sur les animaux
Dans les différents modèles de cancer utilisés dans ce projet, l’étape d’irradiation rend la souris fragile aux infections et peut favoriser la présence d’une diarrhée et induire une perte de poids. Le développement des tumeurs peut lui aussi entraîner des nuisances telles que la douleur, une paralysie, une perte de poids, ou une insuffisance respiratoire (pour les tumeurs pulmonaires). L’injection intraveineuse de cellules tumorales peut également causer du stress et de la douleur au moment de l’injection. En revanche, l’imagerie, bien que non invasive peut provoquer du stress lié à la manipulation. Pour cette procédure, les souris sont préalablement anesthésiées avec de l’isoflurane. L’anesthésie gazeuse peut perturber la régulation de la température corporelle des souris, et la répétition fréquente de ces anesthésies (deux fois par semaine pendant toute la durée de l’étude et à 24h d'intervalle au moment du début du traitement) peut avoir un impact sur leur bien-être. Les prélèvements de sang à la mandibule (réalisés une fois par semaine pendant toute la durée de la procédure) peuvent provoquer une légère douleur temporaire et du stress. Comme leur nom l’indique, ces prélèvements peuvent entraîner un saignement mineur au site de ponction, généralement contrôlé en appliquant une légère pression. La chirurgie nécessaire à l’injection des cellules cancéreuses au niveau de la rate ou du foie implique l’ouverture de la paroi abdominale. Cela peut entraîner des douleurs post opératoires, des problèmes de cicatrisation de la plaie chirurgicale et des effets secondaires tels qu’une infection, une hypothermie, une réaction inflammatoire locale et une altération temporaire du comportement alimentaire.
Tous les animaux seront systématiquement euthanasiés au maximum 4 mois post-injection si pas d’atteinte du point limite. Les organes liés au système immunitaire, ainsi que ceux associés à notre population thérapeutique d’intérêt (comme le poumon et les muqueuses intestinales), seront prélevés en post-mortem pour une analyse au niveau cellulaire.
Objectifs
L’immunothérapie, une avancée majeure en médecine, a bouleversé la façon dont nous luttons contre le cancer et d’autres maladies. Contrairement aux traitements traditionnels, tels que la chimiothérapie ou la radiothérapie, qui ciblent directement les cellules cancéreuses, l’immunothérapie tire parti du système immunitaire du patient (système de défense de l’organisme contre les infections) pour combattre la maladie. Dans notre projet, nous nous concentrons sur plusieurs types de cancers hématologiques (leucémie et lymphome) et de cancers « solides », notamment les cancers du poumon, du sein et du foie. Notre objectif est de trouver une nouvelle approche qui pourrait être utilisée pour traiter ces cancers de manière plus efficace. L’une de nos stratégies consiste à utiliser des cellules du système immunitaire appelées lymphocytes T. Ces cellules sont des gardiens du système immunitaire qui patrouillent dans notre corps pour détecter et éliminer les menaces, y compris les cellules cancéreuses. Cependant, il existe deux types de lymphocytes T : les lymphocytes « conventionnels » et les lymphocytes T « non conventionnels ». Les lymphocytes T « conventionnels » sont des guerriers spécialisés qui sont parfois difficiles à obtenir chez les patients, en particulier s’ils ont déjà reçu des traitements agressifs. De plus, ils peuvent causer des effets secondaires indésirables, comme la destruction de cellules saines de notre corps. Nous explorons donc une approche novatrice en utilisant des lymphocytes T « non conventionnels ». Ces cellules proviennent de donneurs en bonne santé et pourraient être utilisées pour stimuler le système immunitaire du patient afin de lutter contre les cellules cancéreuses. Ce serait une sorte de traitement universel, efficace pour différents types de cancers, indépendamment du patient. Notre travail vise à rendre ces thérapies plus accessibles, moins coûteuses et à Réduire les effets secondaires, tout en offrant un nouvel espoir à ceux qui luttent contre le cancer du poumon, du sein, du foie et d’autres types de cancer.
Bénéfices attendus
Notre projet vise à démontrer la possibilité d’utiliser une autre population de cellules du système immunitaire permettant de traiter les patients atteints de cancer. Cette nouvelle stratégie thérapeutique éviterait les problématiques actuellement rencontrées avec des traitements similaires. La validation de nos hypothèses dans un modèle animal servira de base au développement de stratégies thérapeutiques innovantes pour améliorer les taux de guérison de pathologies cancéreuses graves.
Remplacement
Pour tester l’efficacité de nos différentes thérapies, nous avons d’abord réalisé de nombreuses expériences en laboratoire (in vitro). Ces expériences nous ont permis de valider certaines réponses des cellules aux traitements, en utilisant différentes techniques dont des modèles en trois dimensions appelés sphéroïdes. Cependant, pour obtenir des résultats plus proches de ce qui se passe dans le corps humain, nous devons passer à des tests dans des modèles vivants (in vivo). Ces modèles intègrent des caractéristiques importantes des tumeurs humaines, telles que l’hétérogénéité des cellules tumorales, la présence de tissus sains et des barrières qui peuvent limiter l’efficacité des traitements. Il est donc impossible de poursuivre la validation de notre nouvelle approche thérapeutique sans utiliser un modèle animal entier vivant.
Réduction
Nous avons réduit le nombre de souris utilisées au minimum nécessaire et suffisant pour valider scientifiquement notre étude du point de vue de l’analyse statistique. L’utilisation de l’imagerie in vivo permet également de Réduire le nombre d’animaux utilisé grâce à l’analyse d’une même souris sur toute la durée de l’expérience.
Raffinement
Afin de Réduire au minimum la douleur et la souffrance qui pourraient être ressenties par les souris, nous prévoyons la mise en place de différentes procédures. Tout d'abord, les souris sont hébergées dans une animalerie avec un statut sanitaire contrôlé, un enrichissement sera mis en place (papier kraft pour la fabrication de nid, buchette en bois à ronger). Un suivi visuel quotidien (par les animaliers et/ou les expérimentateurs) des animaux est réalisé. Nous veillerons, par ailleurs, à Réduire au minimum l’intensité et la durée des souffrances ressenties par les animaux, en utilisant deux fois par semaine une grille d'évaluation prenant en compte l'apparence physique, le poids et le comportement des animaux. De plus la mesure bi-hebdomadaire par imagerie in vivo, nous permettra d'évaluer la propagation tumorale et euthanasier les animaux si celle-ci devient trop invasive et avant que les signes cliniques n’apparaissent (paralysie par exemple). Les imageries seront réalisées sous anesthésie. Lors de cette mesure de bioluminescence, nous effectuerons un suivi clinique des souris et établirons un score selon des critères de poids, d’apparence des poils, de mobilité, de comportement ainsi que de rythme respiratoire (pour les tumeurs pulmonaires) et des observations post-opératoires telles que l’état de la plaie et les déplacements de la souris après l’opération (pour la tumeur du foie, nécessitant une chirurgie).La chirurgie sera réalisée sur des souris anesthésiées et ayant reçu au préalable l’administration d’anti-douleur, administration qui sera poursuivie dans les jours qui suivent.
Etude des effets de candidats médicaments dans un modèle préclinique d’hypertension artérielle pulmonaire
Choix de l'espèce
Même si de nombreuses espèces animales sont concernées, la majorité des modèles d’HTAP ont été développés chez le rat adulte parce qu’il permet d’obtenir, après induction de la pathologie, des données hautement reproductibles. De plus, les rats présentent des modifications cardiovasculaires similaires à l’homme : modifications des pressions, remodelage vasculaire et cardiaque, perte de fonction. Finalement, ce modèle d'HTAP développé chez le rat représente un modèle de référence pour l’étude de l’HTAP car la progression de la pathologie est continue au cours du temps et mime ainsi l’évolution délétère de la maladie observée chez l’homme. Des rats de 4/6 semaines au moment où ils arrivent en acclimatation dans nos locaux sont utilisés pour ce modèle. Ce modèle est sensible à l’âge et des animaux plus âgés ne présentent pas le même développement de la pathologie.
procédures
Une injection sous-cutanée (S.C.) du composé diminant la formation des vaisseaux est réalisée sous anesthésie gazeuse. Les animaux sont ensuite placés dans une enceinte d’hypoxie pendant 3 semaines avant de retourner en condition de normoxie (conditions d'hébergement classique) durant 0 à 6 semaines. Pendant la période de normoxie, les animaux pourront être traités quotidiennement, une à 2 fois par jour selon le composé testé, par gavage, injection intrapéritonéale (I.P.), sous-cutanée (S.C.), ou intranasale (I.N.). Des injections intraveineuses sous anesthésie gazeuse pourront également être réalisées 1 à 2 fois par semaine. Durant la normoxie, des prélèvements de sang à la veine jugulaire ou des examens échocardiographiques de suivi pourront être réalisés sous anesthésie gazeuse. A la fin du protocole, une chirurgie sous anesthésie gazeuse et analgésie est réalisée afin de mesurer les pressions artérielles en insérant un cathéter relié à un capteur de pression dans l’artère carotide. Une thoracotomie est ensuite réalisée afin d’insérer un cathéter dans le ventricule droit puis dans l’artère pulmonaire pour des mesures de pressions. Un prélèvement de sang terminal intracardiaque pourra être réalisé avant la mise à mort des animaux par surdose de produit euthanasiant.
Impact sur les animaux
Les animaux sont soumis à une anesthésie gazeuse et reçoivent une injection sous-cutanée pour induire une hypertension artérielle pulmonaire. Ils sont ensuite placés dans une enceinte d’hypoxie pendant 3 semaines. L’humidité dans l’enceinte est supérieure à 80%. En hypoxie, les animaux présentent une prise de poids ralentie de 50% par rapport à une stabulation conventionnelle à cause du stress et de l’asthénie provoqués par la déplétion en oxygène. De plus, le confinement dans l'enceinte d'hypoxie génère un inconfort, indépendamment de l'hypoxie elle même, via une humidité élevée et un risque d'accumulation d'ammoniaque et de CO2. De plus, le niveau sonore est plus élevé dans les caissons hypoxiques que dans les salles d'hébergements classiques pouvant engendrer du stress et de l'inconfort pour les animaux.A la fin de ces 3 semaines d’hypoxie, ils retournent dans la pièce d’hébergement conventionnelle pendant 0 à 6 semaines, période pendant laquelle la pathologie va s’aggraver et devenir irréversible. A long terme, les animaux peuvent mourir de la pathologie. Pendant la période de normoxie, les animaux pourront être traités quotidiennement, une à 2 fois par jour selon le composé testé, par gavage, injection intrapéritonéale (I.P.), sous-cutanée (S.C.), ou intranasale (I.N.). Ces administrations répétées peuvent êtres associées à des risques de fausses route, d'irritation ou de lésions de l'oesophage (PO), et d'irritations (I.P., S.C.). Des injections intraveineuses sous anesthésie gazeuse pourront également être réalisées 1 à 2 fois par semaine. Des anesthésies gazeuses seront potentiellement réalisées au cours du protocole afin de réaliser des prélèvements de sang à la veine jugulaire ou des examens échocardiographiques de suivi. A la fin du protocole, les animaux sont anesthésiés afin de réaliser un acte chirurgical qui permet de mesurer les pressions artérielles en insérant un cathéter relié à un capteur de pression dans l’artère carotide. Une thoracotomie est ensuite réalisée afin d’insérer un cathéter dans le ventricule droit puis dans l’artère pulmonaire pour des mesures de pressions. Un prélèvement de sang terminal intracardiaque pourra être réalisé avant la mise à mort des animaux par surdose de produit euthanasiant.
A la fin de la procédure, tous les animaux HTAP seront mis à mort afin de récupérer des organes pour des analyses de tissus (cœurs, poumons, artères pulmonaires) et/ou des analyses de morphologie des organes (pesée des deux ventricules du cœur). Les mesures de pressions dans le ventricule droit sont également trop invasives pour envisager un réveil des animaux. Un prélèvement de tissu sur les animaux Sham (non porteurs d'un HTAP) est nécessaire pour comparer aux conséquences cardiovasculaires des animaux porteurs de la maladie.
Objectifs
L’hypertension artérielle pulmonaire (HTAP) est une maladie cardiovasculaire et pulmonaire rare et grave : sa prévalence dans la population générale en France est estimée à 15 cas par million et la survie médiane sans traitement après diagnostic est inférieure à 3 ans. Elle se caractérise par l’augmentation des résistances artérielles pulmonaires, responsable d'une hypertension, et aboutit à une insuffisance cardiaque. Cette maladie peut survenir de cause inconnue, dans un contexte familial ou compliquer l’évolution de certaines pathologies (insuffisance cardiaque). En identifiant et en traitant les patients le plus tôt possible, il est possible de retarder la progression de l'HTAP. Malheureusement, cette maladie est souvent mal diagnostiquée et traitée, car les symptômes initiaux sont légers et peu spécifiques (essoufflements, lipothymie et asthénie). Si les options thérapeutiques ont progressé ces dix dernières années et ont permis d'améliorer les conditions de vie des malades, la prise en charge de l'HTAP demeure incomplète car ne prolonge pas significativement le durée de vie après diagnostic. Ainsi, la recherche de médicaments ciblant de nouveaux mécanismes physiopathologiques reste un enjeu majeur pour les années à venir. Les tests de nouvelles molécules doivent se réaliser sur des modèles animaux suffisamment prédictifs de la maladie, afin d’optimiser la sélection des candidats médicaments qui entreront en phase clinique. Le modèle présenté d'HTAP chez le rat, induit conjointement par l’administration d'un composé diminuant la formation de vaisseaux sanguins et par une hypoxie (diminution des apports en oxygène) chronique, est un modèle qui reproduit l'ensemble des caractéristiques physiopathologiques décrites chez l'Homme, à savoir une atteinte vasculaire qui est associée à long terme avec le développement d'une insuffisance cardiaque droite. De plus, les traitements actuellement proposés chez l'Homme montrent des résultats bénéfiques significatifs dans ce modèle. Ainsi, ce modèle d'HTAP représente un modèle préclinique de choix pour l’étude de l’HTAP. Ce modèle nous permettra d’évaluer, chez le rat, l’efficacité de nombreux candidats médicaments qui s’intéressent à des mécanismes d’actions connus (atteintes vasculaires) et des cibles thérapeutiques nouvelles (atteintes cardiaques). Ce modèle nous permettra également une meilleure compréhension des mécanismes mise en jeu dans la maladie afin d’améliorer la prise en charge des patients.
Bénéfices attendus
L’HTAP est une maladie rare et grave pour laquelle il n’existe actuellement pas de traitements curatifs efficaces. Si les traitements prescrits actuellement, essentiellement des vasodilatateurs, permettent une amélioration de la qualité de vie des patients et une prolongation de la survie en freinant l’évolution de la pathologie, la moitié des patients décèdent dans les sept ans qui suivent le diagnostic. Compte-tenu de l’évolution de l’HTAP dans ce modèle animal qui mime fidèlement la maladie humaine, la réalisation d’études précliniques utilisant des candidats médicaments novateurs apparait primordiale pour mettre en évidence de nouvelles pistes thérapeutiques. Ainsi, à terme, l’utilisation de ce modèle animal permettra de sélectionner des composés présentant des bénéfices sanitaires significatifs en vue d’essais cliniques.
Remplacement
S'il existe un certain nombre de modèles de culture de cellules musculaires lisses, ces modèles in vitro sont utilisés en première intention (modèles de screening) et sont utilisés uniquement pour tester des activités moléculaires et identifier des voies de signalisation. Ces modèles cellulaires in-vitro ne permettent pas de tester l'efficacité d'un candidat médicament sur l'aspect de la restauration hémodynamique et morphologique mais sont utilisés en amont afin de sélectionner les meilleurs candidats à tester sur nos modèles in vivo. La validation de la formation aux techniques de mesures de pressions nécessite d’avoir recours à des animaux vivants car les phases critiques de l’approche chirurgicale reposent sur les risques hémorragiques qui peuvent entraîner des mesures de pression faussées, voir la mort de l’animal.
Réduction
Pour chaque groupe avec une HTAP, le nombre d'animaux nécessaire par groupe est fixé à 11. Ce nombre a été déterminé par un calcul de N, sur la base de données obtenues préalablement et prenant en compte les moyennes et déviations standards mesurées pour chaque paramètre. Basés sur les données historiques dans ce modèle d’HTAP, un pourcentage de perte de 15% est attendu jusqu’à 3 semaines de normoxie, correspondant aux animaux qui meurent au cours du protocole à cause du développement de la pathologie. Le nombre d’animaux inclus dans chaque groupe en début d’étude est donc de N=13. Lorsque le protocole inclus une période de normoxie supérieure à 3 semaines (jusqu’à 6 semaines), le nombre d’animaux par groupe est fixé à N=18 car le développement de la pathologie entraîne une mortalité plus importante des animaux (jusqu’à 40% de perte). Généralement, le groupe contrôle négatif (non malade) n’est composé que de 6 animaux car il y a peu de variabilité des paramètres cardiovasculaires étudiés. Ainsi, 1800 rats HTAP sont prévus dans le cadre de cette procédure et 120 rats Sham. Des échantillons de plasmas et/ou de tissus d'animaux sont prélevés à l'issue de certaines séries expérimentales et conservés pour pouvoir être utilisés dans le cadre d’autres projets de recherche (par exemple recherche d’un récepteur cible présent dans le plasma ou dans les tissus cardiaques ou vasculaires). L'utilisation de ces banques de tissus pour d'autres projets de recherches permet de Réduire significativement le nombre d’animaux utilisés car il permet de Réduire le nombre de séries expérimentales réalisées.
Raffinement
l’arrivée des animaux, une période d'acclimatation d’au moins 5 jours est respectée. L'administration du composé induisant la pathologie est réalisée sous anesthésie gazeuse. Pendant les 3 semaines d'hypoxie, les animaux sont hébergés dans des grandes cages en plexiglass prévues à cet effet avec une sciure particulièrement absorbante (8 animaux par cages). Les caissons d’hypoxie sont ouverts et nettoyés tous les jours. De la chaux sodée est placée dans le caisson pour absorber le C02 et changée tous les jours, de l'acide borique permet d'absorber l'ammoniaque générée par les urines et est remplacé toutes les semaines ; et des absorbeurs d'humidité sont présents pour absorber l'humidité assurant des conditions correctes pour les animaux. La ventilation des caissons peut également être adaptée à l’aide d’aérations présentes sur les caissons dont l’ouverture et la fermeture peut être ajustée pour diminuer une humidité excessive. Les animaux sont observés quotidiennement et tout signe de douleur ou de détresse entraîne l’établissement d’un score grâce à une grille d’évaluation du bien-être animal. En fonction du score obtenu, un protocole d’analgésie approprié est mis en place si besoin. Des points limites spécifiques au protocole sont également établis (présence de plaies cutanées, fausse route…) Si des prélèvements de sang sont réalisés au cours du protocole, les animaux sont anesthésiés. Une anesthésie locale est également réalisée. Les rats sont placés sur un tapis chauffant avec contrôle de la température, et une réhydratation est réalisée en injectant en S.C. 3 fois le volume prélevé en NaCl ou Ringer Lactate. Si des injections en voie I.V. sont réalisées, les animaux sont anesthésiés avec une analgésie locale et contôle de la température corporelle. Les mesures hémodynamiques réalisées en fin de protocole se font sur animaux anesthésiés ayant reçus une injection préalable d'analgésiant au minimum 30 minutes avant la première incision. Pour chaque anesthésie, les animaux sont placés sur un tapis chauffant retro-contrôlé et du gel ophtalmique est déposé sur leurs yeux
Restriction alimentaire modérée chez la truite arc en ciel
Choix de l'espèce
La truite arc-en-ciel (Oncorhynchus mykiss) est une espèce robuste dont l’élevage, la croissance et la reproduction sont bien maîtrisées en pisciculture. Il s’agit d’une espèce d’intérêt agronomique puisqu’elle représente 95% de la production française piscicole en eau douce. Elle est par ailleurs un modèle biologique largement diffusé dans la communauté scientifique (>50 000 références). C’est une espèce avec une très grande plasticité de croissance. Cette espèce n'est pas incluse dans la liste des espèces identifiées comme devant provenir d’élevage ou de fournisseurs agréés. Les poissons utilisés auront un poids compris entre 5 et 25g, car c'est à ce poids qu'il y a le plus de cellules souches musculaires dans le muscle de truite.
procédures
Les animaux seront soumis à une restriction alimentaire légère afin de ralentir leur croissance, puis ils seront euthanasiés pour réaliser des prélèvements. Nous prélèverons 500 animaux de 5-25g par an.
Impact sur les animaux
Les animaux vont être nourris 2 jours par semaine (lundi et jeudi) ce qui va potentiellement engendrer une sensation modérée de faim pendant au maximum 5 jours par semaine.
A l'issue de chaque procédure les animaux seront mis à mort par une personne compétente désignée par les responsables de projet. En effet, l'extraction des cellules du muscle nécessite l'euthanasie des animaux. Les responsables du bien-être des animaux sont bien sûr informés.
Objectifs
Les cellules souches musculaires qui sont des précurseurs myogéniques, sont indispensables à la croissance du muscle. Pour déterminer précisément la régulation de l'activité de ces cellules souches, nous utilisons un modèle d'étude in vitro de la myogénèse basé sur la culture primaire de ces cellules. La quantité de ce ces cellules dans le muscle diminue rapidement avec la croissance, ce qui nous conduit à devoir utiliser des poissons d'un poids compris entre 5 et 25 g. Néanmoins, la croissance des truites est très rapide à ces stades là et les animaux passent de 5 g à 25g en 2 mois ce qui limite considérablement nos capacités d'expérimentation puisque la truite est une espèce saisonnière qui pond une fois par an. Le projet a pour objectif de ralentir la croissance des animaux pour obtenir des poissons de 5-25 g en décalé et ainsi pouvoir réaliser des expérimentations sur une plus grande partie de l'année. Une fois réalimentés pour être en pleine croissance, ces animaux seront euthanasiés et le muscle sera prélevé pour étudier les modalités de croissance.
Bénéfices attendus
Grâce à ce modèle in vitro de myogénèse, nous cherchons à élucider les mécanismes moléculaires qui régulent l'activité des cellules du muscle. A termes, ces recherches devraient permettre une meilleure maîtrise de la croissance des poissons, et de la qualité de la chair des poissons.
Remplacement
Il n'existe pas de lignée cellulaire de muscle de truite capable de proliférer et de se différencier in vitro. Il est donc nécessaire de prélever les cellules couches musculaires à partir de muscle de truite.
Réduction
Nous limiterons le nombre de poissons restreints à 500 poissons par an, ce qui nous permet de faire 10 extractions de cellules par an.
Raffinement
Les animaux seront élevés dans un environnement optimal pour l’espèce (photopériode, qualité d’eau, densité, enrichissement). Les paramètres physico-chimiques de l’eau (température, O2, NH4+) seront également régulièrement contrôlés.
Effet de la Température sur les capacités de Navigation et l’activité Cérébrale chez la seiche
Choix de l'espèce
La seiche commune (Sepia officinalis), est une espèce modèle bien étudiée en neuroéthologie. Son anatomie cérébrale, ses capacités cognitives et comportements complexes sont largement démontrés. Il s’agit d’une espèce évoluant dans un milieu fortement soumis aux pressions anthropiques dont font partie les changements de température aquatique. La mise au point d’un système d’enregistrement d’ondes cérébrales au cours d’une tâche comportementale chez cette espèce représente deux intérêts majeurs : mesurer l’impact de changements de conditions environnementales sur des capacités cognitives essentielles à la survie de l’espèce et bénéficier d’un outil permettant plus généralement d’explorer le bon fonctionnement cérébral. De plus, comme chez d’autres espèces de mollusques céphalopodes utilisés dans la recherche, plusieurs critères visuels (patterns liés aux chromatophores, présence ou non de lésions) et comportementaux (comportements de prédation, flottaison, mouvements désordonnés, propulsions, jets d’encre excessifs) sont utilisés chez la seiche commune pour attester de son état physiologique (bien-être, souffrance, stress). Les animaux utilisés seront des seiches adultes âgées de un ou deux ans, de taille assez importante pour faciliter les étapes de chirurgie et dont le développement cognitif (mémoire) est mature. Les individus ayant déjà pondu (en fin de vie) seront privilégiés.
procédures
Une mise au point de la technique d’enregistrement d’ondes cérébrales sera faite chez un premier groupe d’animaux anesthésiés à l’aide d’électrodes cérébrales reliées à un amplificateur. L’installation de ces électrodes est faite chez un premier groupe 15 d’animaux sous anesthésie et l’enregistrement dure 40 minutes chez l’animal maintenu en anesthésie continue. Une seconde étape de mise au point de ce protocole sera réalisée cette fois chez 15 animaux vigiles sur deux heures d’enregistrement. Une fois les ajustements de protocole réalisés, un nouveau groupe de 15 animaux sera équipé d’un système d’enregistrement d'électroencéphalographie (EEG) miniature et sans fil appelé neurologger. Celui-ci est contenu dans un boitier étanche fixé sur le dos de l’animal relié à des électrodes d’enregistrement placées au niveau du cerveau. Ces interventions chirurgicales seront réalisées sous anesthésie en une fois. Les animaux ainsi équipés évolueront librement dans un bac d’eau de mer à 18°C pendant trois jours puis à 12°C, 18°C ou 24°C pendant les trois jours suivants. Les enregistrements dureront 12h par jour, un jour sur deux. Il sera alors possible de comparer les enregistrements EEG à ces différentes températures. Enfin, le dernier objectif consiste à évaluer les compétences de navigation spatiale à différentes températures. Pour cela deux groupes d’animaux seront constitués, l’un composé d’animaux équipés du neurologger (60 seiches), l’autre non équipé (60 seiches). Les deux groupes seront soumis à une tâche d’apprentissage spatial dans un labyrinthe en T à 18°C durant trois jours. Une tâche de rappel sera réalisée à l’issue de cet apprentissage à l’une des trois températures suivantes (20 animaux par température et par groupe) : 12°C, 18°C ou 24°C.
Impact sur les animaux
Des nuisances peuvent être attendues sur les seiches suite à l’implantation des électrodes au niveau du cerveau et du neurologger sur leur dos (coquille interne appelée communément os de seiche). Cette chirurgie sera faite sous anesthésie induite préalablement par balnéation. Cette induction est considérée comme étant effective lorsque les critères comportementaux suivants sont observés : perte de mouvements, pâlissement du manteau, perte de réaction suite à une stimulation mécanique (pincement au niveau de la nageoire), diminution d’adhérence des ventouses. Cette anesthésie induite sera accompagnée d'une analgésie locale. Cette chirurgie pourra néanmoins occasionner une gêne temporaire dans les heures suivant l’implantation liées à la cicatrisation des zones d’implants (au niveau de la peau recouvrant le cartilage protégeant le cerveau et au niveau de la peau recouvrant la coquille). Les dimensions (poids et taille) du neurologger seront adaptées à la taille de l’animal de façon à ne pas gêner ses déplacements. Néanmoins les fils reliant les électrodes d’enregistrement (au niveau de la tête) au boitier étanche contenant le neurologger (au niveau du dos) peuvent occasionner une légère gêne lors de certains mouvements de la tête. Ce point sera particulièrement surveillé lors de la mise au point des techniques d’enregistrement afin de limiter au maximum cette gêne (adaptation de la rigidité et longueur des fils). De plus, le boitier étanche dans lequel se trouvera le neurologger sera amovible. Aussi les températures choisies pour étudier l’effet de leur changement se trouve dans les gammes de températures proches des conditions naturelles donc n’occasionneront pas de stress supplémentaire.
Tous les animaux impliqués, à l’exception des animaux ne portant pas de dispositif d’enregistrement EEG, seront mis à mort à la fin des derniers enregistrements de chaque procédure, sans délai. Cela permettra de prélever leur cerveau afin de retracer la localisation précise des électrodes utilisées pour les enregistrements.
Objectifs
Ce projet vise à évaluer les effets de changements de température de l’eau sur le fonctionnement cérébral et les capacités de navigation de la seiche commune (Sepia officinalis). Des perturbations environnementales, à l’image des changements de température, peuvent modifier le fonctionnement cérébral des animaux marins. Cela peut engendrer une diminution de flexibilité comportementale et in fine du taux de survie des espèces impactées. La seiche commune, comme de nombreux autres mollusques céphalopodes, présente des capacités cognitives complexes et une diversité comportementale importante dont dépendent leur survie. Cependant il n’existe à ce jour aucun moyen d’étudier le fonctionnement cérébral in vivo au cours de diverses tâches comportementales. L’objectif de ce projet est donc d’adapter chez la seiche un système d’enregistrement cérébral ayant déjà été utilisé chez le poulpe (céphalopode également) afin d’évaluer la fluctuation de l’activité cérébrale en fonction de la température de l’eau dans laquelle elles évoluent (successivement 12°C, 18°C et 24°C). Il sera alors possible de mesurer l’activité cérébrale au cours d’une tâche de navigation spatiale à de telles températures chez des seiches équipées de ce système.
Bénéfices attendus
Les seiches sont des animaux d'intérêt économique, écologique et scientifique majeurs. Elles représentent en effet une partie importante des stocks de pêche en France, font partie intégrante des écosystèmes marins et sont au centre de nombreuses études en cognition animale et neurobiologie. Comme de nombreuses autres espèces marines, leur survie est en grande partie dépendante de leur flexibilité comportementale. Celle-ci découle d’un fonctionnement cérébral pouvant être sensible à des changements environnementaux. Notre étude vise d’une partà mieux cerner l’impact que peuvent avoir les changements de températures sur les capacités cognitives des seiches et d’autre part de savoir comment l’activité cérébrale associée peut en être modifiée. Associés, ces objectifs permettraient sur le long terme de faire de la seiche un modèle d’étude émergent contribuant à mesurer les effets des pressions anthropiques sur les espèces marines à plus large échelle. Plus globalement ils pallieraient la difficulté actuelle à tisser des liens directs entre conditions environnementales, modification du fonctionnement cérébral et des comportements, en particulier chez des espèces marines.
Remplacement
Le point central de ce projet est de pouvoir mesurer les effets de l’activité cérébrale chez des seiches libres de leurs mouvements, lors de la réalisation d’une tâche de navigation (enregistrements pendant les phases d’apprentissage et de rappel). Il en est de même pour étudier l’effet de changements de température sur la cognition spatiale. Le recours à des animaux vivants est donc indispensable.
Réduction
La mise au point du système d’enregistrement consistera à adapter un protocole de chirurgie pour l’implantation des électrodes au niveau du cerveau et de l’appareil sur le dos des seiches. Il conviendra donc de réaliser ces ajustements de protocole dans un premier temps sur des seiches mortes (pêchées au chalut et achetées à la criée). Les seiches de deux ans utilisées par la suite seront pêchées au casier, après qu’elles se soient rapprochées des côtes pour pondre et entrer en sénescence. Par conséquent le prélèvement de ces animaux n’induit pas de perturbation au niveau de leur population. Concernant les protocoles, des tâches comportementales non invasives seront réalisées chez des animaux ne portant pas d’appareil d'enregistrement afin de constater au préalable l’effet de la température de l’eau sur le comportement “de base” (locomotion, prédation, phases d’activité et de repos) mais aussi sur les capacités de navigation. Ainsi, le nombre d’animaux utilisés en conditions avec enregistrements (i.e chez qui les étapes d’anesthésie, de chirurgie et de mise à mort seront appliquées) sera réduit et chaque animal ayant fait tests comportementaux pourra réintégrer la structure d’élevage. Les analyses statistiques a posteriori seront faites à l’aide de tests non paramétriques conçus pour des échantillons de faible effectif.
Raffinement
La capture des animaux dans la nature sera faite par du personnel habilité, à l’aide de relevés de casiers en pleine mer. Par ailleurs, les animaux seront hébergés dans des infrastructures adaptées à cette espèce. Les seiches sont des animaux non sociaux et des interactions agonistes peuvent avoir lieu entre les individus évoluant dans le même bac lors de la période de reproduction. Il est donc préférable d’isoler les individus dans des bacs d’élevage pourvus d’enrichissements (plantes artificielles et abri). Les étapes de chirurgie seront toutes précédées d’une phase d’anesthésie adaptée, prolongée jusqu’à la fin des interventions. Une fois l’anesthésie effective, les animaux seront placés sur un support de chirurgie équipé d’un système de circulation d’eau et de solution anesthésiante au niveau de leurs branchies et un film plastique sera placé sur leur dos pour maintenir l’humidité au niveau de leur manteau. La hauteur d’eau sera ajustée pour maintenir la tête et le dos des animaux émergés et permettre les actes chirurgicaux. Une injection de solution analgésiante sera également réalisée localement au niveau des zones d’incision dorsale et de la tête. De manière à n’avoir recours qu’à une seule étape d’anesthésie générale et limiter le nombre de manipulations des animaux, l’implantation des électrodes et du boîtier contenant le neurologger, le cas échéant, se fera au cours de la même procédure. Après la chirurgie, les animaux équipés seront replacés dans leur bac d’élevage et surveillés pendant 48h afin de prévenir toute manifestation de souffrance ou de stress. L’emplacement, les dimensions et le poids du boîtier et du neurologger qu’il contient seront choisis de manière à ne pas limiter les mouvements naturels de l’animal suite à l’implantation.
Evaluation de l’immunogénicité de candidats vaccins chez le Guinea Pig.
Choix de l'espèce
Le cobaye a été choisi pour ce projet car le système immunitaire de cette espèce est très bien caractérisé et la réponse immunitaire est robuste. De plus, le cobaye présente une similarité immunologique plus proche de celle de l’homme comparé à d’autres modèles animaux tels que la souris, permettant ainsi de mieux prédire la réponse immunitaire chez l’homme. Les animaux seront inclus dans les études entre 250 et 500g correspondant à environ entre 3 et 6 semaines pour les mâles et entre 4 et 7 semaines pour les femelles. A ce stade de développement les animaux sont adultes et ont un système immunitaire mature. Leur poids permet le prélèvement de volume de sang suffisant et répété pour réaliser les analyses du taux d’immunogénicité mais également d’autres tests biochimiques.
procédures
Les animaux seront soumis à une injection unique ou répétée (maximum 3 injections durant l’étude) par voie per-os, sous-cutanée, intrapéritonéale (vigiles) ou intramusculaire (sous anesthésie) des produits tests en respectant les volumes d’injection recommandés. Sur animaux vigiles, ces administrations seront réalisées en environ 1 minute, pour les administrations IM réalisées sous anesthésie la durée est d’environ 5 minutes. Des prélèvements sanguins seront réalisés sur animaux anesthésiés au maximum 1 fois par semaine (et avant euthanasie) jusqu’à la fin de l’étude en respectant les volumes éthiques recommandés. Un prélèvement s’effectue en moyenne en 5 minutes (anesthésie comprise).
Impact sur les animaux
Les animaux pourront présenter des réactions immunitaires différentes selon les produits testés. Il est possible que leur système immunitaire soit affaibli entrainant l’apparition de signes cliniques (général : perte de poids, prostration, Réduction de la mobilité ou local : rougeur, gonflements, lésions au site d’injection). Les animaux seront manipulés régulièrement pour différents actes (pesées, administration des produits, prélèvements de sang) et pourront subir plusieurs anesthésies au cours des études susceptibles d’induire un stress.
Les animaux seront euthanasiés à la fin du protocole car seul des animaux naïfs peuvent être utilisés, ils ne pourront donc pas être inclus dans d’autres protocoles. De plus dans certains cas, des organes pertinents (tels que la rate, les ganglions lymphatiques et la moelle osseuse) seront prélevés pour déterminer l’immunogénicité des produits testés.
Objectifs
Selon l'OMS, les maladies infectieuses sont responsables dans le monde de 17 millions de décès par an, soit un tiers de la mortalité et 43 % des décès dans les pays en voie de développement (contre 1 % dans les pays industrialisés). Les maladies infectieuses recouvrent un large spectre de pathologies bénignes comme le rhume ou l’angine, mais également très graves comme l'infection par le virus de l'immunodéficience humaine, les hépatites, le paludisme, la tuberculose, etc. Si la recherche a permis l’éradication de certaines d’entre elles grâce à la mise au point de vaccins spécifiques et des antibiotiques, il reste encore beaucoup de chemin à parcourir pour que toutes ces pathologies soient traitées. Dans le cas du développement d'un vaccin, il convient de s'assurer que le candidat vaccinal permet d'induire une réaction immunitaire spécifique chez l'animal sain après injection, permettant le développement d'anticorps spécifiques contre la pathologie visée, avant la réalisation d'études d'efficacité (challenge vaccinal). Ce projet a donc pour objectif de caractériser l'immunogénicité de candidats vaccins après administration chez le cobaye.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de sélectionner de nouveaux candidats vaccins pour des études d'efficacité, et ainsi contribuer au développement de nouveaux vaccins contre de nouvelles cibles ou plus performants que ceux actuellement disponible sur le marché.
Remplacement
Le recours à l’expérimentation animale est nécessaire afin de pouvoir caractériser l'immunogénicité d’un produit dans un organisme entier vivant (modélisation d’une situation clinique). Actuellement, il n’existe pas de méthode alternative permettant de modéliser de manière fiable la réaction immunitaire induite d’un produit dans un organisme vivant.
Réduction
Afin d’obtenir des résultats statistiquement exploitables permettant de conclure sur un réel pouvoir immunogène du traitement testé, des groupes d’au moins 5 animaux seront constitués. Un groupe contrôle ne sera pas systèmatiquement prévu car un prélèvement de sang "baseline" sera réalisée en amont des administrations sur tout les animaux et servira de contrôle pour l'ensemble des anaylses de l'étude (dosage des anticorps spécifiques et/ou analyses biochimiques).
Raffinement
Une période d’acclimatation de 7 jours minimum sera respectée pour les cobayes. Les animaux seront hébergés en groupes sociaux en parcs ou en cages (hors isolement des animaux pour agressivité ou blessure qui pourra être jugé nécessaire par le vétérinaire) avec les enrichissements appropriés (bâtonnets de bois, galets de foin ainsi qu’une plateforme et une cachette). Les animaux seront observés quotidiennement afin de déceler précocement tout signe clinique anormal et de mettre en place des mesures de prise en charge aussi rapidement que possible (mesures de soutien de type désinfection de plaies, hydratation, isolement etc. ou mise à mort si nécessaire). Des pesées régulières seront réalisées : minimum 1 fois par semaine et entre 24 et 72h post-administration des candidats vaccinaux. La fréquence des pesées pourra être augmentée en fonction de l’état clinique des animaux : une pesée quotidienne sera réalisée si l’animal est en perte de poids égale ou supérieure à 15% de son poids maximal atteint durant l’étude. Dans les 24 à 72h post-administration des candidats vaccinaux, une observation du site d’injection sera réalisée pour s’assurer qu’aucune anomalie n’est visible. Les administrations des produits en intramusculaire seront réalisés sous anesthésie. Lors des anesthésies, du gel oculaire sera appliqué sur la cornée des animaux pour éviter une déshydratation et une attention particulière sera portée pour éviter l’hypothermie : mise en place de tapis chauffant et/ou réveil des animaux sous lampe chauffante.
Mise au point de procédures d’évaluation de la personnalité chez la perdrix rouge
Choix de l'espèce
Les perdrix rouges sont des gallinacés emblématiques des milieux ouverts du bassin méditerranéen. Leurs populations sont en fort déclin actuellement et un certain nombre de programmes de conservation vise à utiliser les populations captives pour des repeuplements. Cependant, la réussite de ces programmes reste mitigée et il convient donc de trouver de nouveaux outils pour améliorer leur efficacité. Les perdrix utilisées seront des adultes âgés de 6 mois. A cet âge le profil comportemental est stable et nous pourrons donc observer des différences interindividuelles robustes, ainsi que de potentielles différences liées au sexe.
procédures
Les animaux seront uniquement soumis à des tests éthologiques de caractérisation du comportement. Les tests individuels sont au nombre de 4 et restent d'une durée inférieure à 30 minutes chaque jour. Le comportement reproducteur est observé en volière extérieur sans intervention sur l'animal.
Impact sur les animaux
Les oiseaux peuvent subir des nuisances lors de la capture puisqu’ils peuvent émettre des réponses de peur à l’approche de l’expérimentateur (fuite et envol). Cependant, le temps de capture est inférieur à 2 minutes, ceci permettant de limiter les risques de blessure de l’animal lors de ces comportements de fuite. L’isolement social lors des tests peut également être une source de stress pour ces oiseaux sociaux. Cependant, cet isolement sera d’une courte durée (moins de 30 minutes par jour et ce un jour sur deux).
Les oiseaux n'ayant pas subi de traitements invasifs, ils seront gardés en vie d'autres expérimentations.
Objectifs
Face à la diminution importante de la biodiversité, de nombreux programmes de conservation proposent de renforcer les populations naturelles par la mise en nature d’individus nés et élevés en captivité. Cependant, il apparait, que pour beaucoup d’entre eux, le taux de survie des individus relâchés est faible, rendant inefficaces les efforts de conservation. Ce faible taux de survie peut être expliqué notamment par une altération des comportements adaptatifs (comportements anti-prédateurs, d’exploration des ressources alimentaires, reproducteurs) chez les animaux nés en captivité. Cependant, au sein d’une même population captive, il existe une très forte variabilité comportementale entre les individus, variabilité qui permet d’identifier des personnalités animales différentes. Certains travaux montrent aujourd’hui un rôle important de ces personnalités animales dans la dynamique naturelle des populations, certaines personnalités étant impliquées dans les processus de dispersion et de colonisation de nouveaux milieux, tandis que d’autres dans le maintien sur une même aire de répartition (sédentarité). Dans ce contexte, le choix de personnalités particulières dans les programmes de repeuplement pourrait être un levier pertinent permettant d’améliorer leur réussite. Aussi, l’objectif de ce projet est de caractériser les différentes personnalités chez la perdrix rouge, espèce dont des populations captives existent et sont mises en nature chaque année en France pour des objectifs de conservation.
Bénéfices attendus
La caractérisation des différentes personnalités chez la perdrix rouge pourrait permettre d'identifier des personnalités plus favorables à la remise en nature et ainsi améliorer la réussite des programmes de repeuplement de cette espèce
Remplacement
Nous travaillons sur la caractérisation des personnalités animales, nous donc devons expérimenter directement sur l’animal vivant, ce qui exclut tout type de Remplacement.
Réduction
Le nombre d’animaux choisi (20 mâles et 20 femelles) permet d’avoir un effectif suffisant pour les comportementales tout en tenant compte d’un possible effet sexe.
Raffinement
Les oiseaux seront hébergés en groupes sociaux mixtes de 5 individus en volières intérieures munies de fenêtres extérieures permettant un éclairage naturel. Chaque volière intérieure sera munie d’une mangeoire et d’un abreuvoir (nourriture et eau à volonté), de litière au sol (copeaux de bois) leur permettant de faire des bains de poussière et de deux abris leur permettant de se soustraire aux perturbations environnementales. Lors de la phase de reproduction, les oiseaux seront placés en volière extérieure de 25m2 (4 couples par volière) comprenant un couvert végétal naturel, de l'alimentation et de l'eau, ainsi que des cachettes pour s'abriter des conditions climatiques. Lors des phases de tests, les oiseaux seront déplacés et manipulés par des personnes compétences et expérimentées. Les phases de tests seront limitées à 30 minutes par jour pour limiter les contraintes pour l’animal. Les oiseaux seront soignés et observés tous les jours par un personnel expérimenté (grille annexe 1). La détection de tout changement de comportement ou de blessure induira un isolement de l'individu pour l’administration de traitement .
Modélisation des maladies inflammatoires de l’intestin au TNBS chez les rongeurs et évaluation prophylactique et thérapeutique de molécules thérapeutiques.
Choix de l'espèce
Le séquençage complet du génome de la souris a démontré la proximité phylogénétique des souris et des hommes : 90 % des gènes humains ont un équivalent chez la souris, permettant d’élaborer des approches génétiques et fonctionnelles valides. Lorsque les gènes orthologues produisent des effets différents entre souris et homme, le Remplacement dans le génome du gène de la souris par son équivalent humain permet la création de lignées humanisées. Ainsi, les souris SCID (Severe Combined ImmunoDeficiency), leurs dérivées et leurs analogues, toutes immunodéficientes, ont permis le développement des modèles humanisés. Pour les souris non humanisées, les animaux seront inclus aux études à partir de l’âge minimum de 6 semaines, animaux matures au niveau de leur système immunitaire. Pour les souris humanisées, les animaux seront inclus aux études à partir de l’âge minimum de 8 semaines, première apparition des cellules immunitaires humaines dans le sang.
procédures
Administration intra-rectale sous anesthésie générale, durée de l'intervention 4 à 5 minutes. Administration des composés à visées thérapeutiques par voie enterale (gavage ou incorporation dans l'eau de boisson) ou parentérale (intraveineuse, intrapéritonéale, intramusculaire ou sous-cutanée). Leur nombre est à déterminer, leurs durées seront de 10 à 15 secondes chacune. Prélèvements sanguins pour le suivi de la pathologie et des effets des traitements selon un schéma établis par le vétérinaire et le comité de bien-être. Chaque prélèvement aura une durée de 15 à 30 secondes, environ. Insertion de sonde caméra intrarectale sous anesthésie pour analyse des intestins, 3 à 4 minutes par analyse.
Impact sur les animaux
Les MICI se caractérisent par une diarrhée pouvant être sévère et entrainer une perte de poids, une déshydratation, des coliques ou une une anémie. Des nuisances peuvent également être induites par l'injection intra-rectale de TNBS solubilisé dans l'éthanol ainsi que par les prélèvements sanguins, l'administration des composés de recherche et les effets potentiellement toxiques de ces composés à visées thérapeutiques dans un contexte préclinique ainsi que par l'endoscopie. Ces nuisances et effets indésirables peuvent se manifester, entres autres, par une perte de poids, une hypo- ou une hyperactivité, une prostration ou des difficultés à se déplacer, une perforation de l'intestin.
Les animaux seront mis à mort en fin de procédure.
Objectifs
La maladie inflammatoire chronique des intestins (MICI) est une pathologie caractérisée par une inflammation de la paroi du tube digestif entrainant une dégradation significative de la qualité de vie des patients. Les MICI les plus courantes sont la colite ulcéreuse (ou rectocolite hémorragique) et la maladie de Crohn. A l’heure actuelle, les mécanismes d’apparition de cette pathologie sont peu connus et aucun traitement curatif n’est disponible sur le marché. L’objectif de ce projet est de développer un modèle d’étude fiable des MICI pour permettre d’en accroitre la compréhension et d’évaluer les propriétés immunitaires, thérapeutiques et toxicologiques de molécules issues de laboratoires académiques, biotechnologiques et pharmaceutiques.
Bénéfices attendus
Les MICI sont des maladies inflammatoires. En basant notre modèle sur des souris ayant un système immunitaire humanisé, nous mettons à disposition des chercheurs un modèle permettant d'étudier les MICI et des potentiels traitements avec davantage de spécificité pour l’espèce cible de ces recherches : l’Homme.
Remplacement
Il n’est à l’heure actuelle pas possible de recréer in vitro un modèle étudiant les interactions complexes qui peuvent exister entre le système immunitaire et un système digestif fonctionnel qui permettrait de reproduire les MICI tout en objectivant les effets thérapeutiques et toxicologiques de composés médicamenteux destinés à leurs traitements. Les modèles murins constituent donc une approche scientifiquement valide, robuste et indispensable au développement et à la mise à disposition de thérapies innovantes pour les patients.
Réduction
Un total de 1500 animaux est demandé pour la réalisation de ce projet sur une durée de 5 ans, permettant de réaliser 50 études afin de mettre en place le modèle et de réaliser les premières études précliniques. Chaque étude comprendra un minimum de 4 groupes (contrôle négatif, contrôlé positif, plusieurs doses ou traitements à comparer) avec 5 à 10 animaux par groupe afin d’obtenir des résultats fiables malgré la variabilité intrinsèque liée au modèle. Le nombre d’animaux utilisés dans chaque étude sera réduit au maximum en se basant sur des tests statistiques adaptés aux effets attendus de la série et sur base des données historiques collectées.
Raffinement
En début d'étude et tout en respectant la réglementation en vigueur, les souris seront hébergées préférentiellement par groupes sociaux stables composés de 5 individus. La nourriture et l’eau de boisson seront fournies ad libitum sauf si le protocole d’étude nécessite un jeûne de nourriture. La durée de ce jeûne ne pourra dépasser 6 heures par semaine. L’eau ne sera jamais retirée des cages. Des compléments alimentaires pourront être administrés suivant l’état de santé des animaux. La cage contiendra à minima une couche de litière permettant aux souris de creuser, de se cacher et de réaliser un nid, élément essentiel à leur bien-être. En outre, des enrichissements de qualité seront fournis dans chacune des cages : morceaux de bois, tunnel en carton, kraft et/ou boules de cotons. Les souris seront hébergées dans une atmosphère contrôlés en permanence. À leur entrée dans l’animalerie, les souris bénéficieront d’une période d’acclimatation de minimum 4 jours. Lors d’un changement de zone au sein de l’animalerie, les souris bénéficieront d’une période d’acclimatation d’une nuit au minimum. Pour gérer la douleur, la souffrance et l’angoisse, nous évaluerons l’état de santé par une échelle de scores appliquée dès le premier geste invasif. Le vétérinaire aura pleine autorité pour euthanasier un animal pour raison éthique ou mettre en œuvre un traitement anti-douleur s’il/elle le juge nécessaire. Concernant les prélèvements sanguins, le volume maximal est de 200µL pour un prélèvement unique, au-delà il s’agira d’un prélèvement terminal sous anesthésie. Les fréquences sont limitées et une réhydratation est prévue pour tout prélèvement unique à partir de 8mL/kg. Les animaux n’attendront pas dans la salle d’euthanasie. Une salle d’attente est prévue à cet effet. Lorsqu’un animal rentre en salle d’euthanasie, il doit être immédiatement euthanasié. Les points limites conduisant à une euthanasie seront fonction des scores cliniques et de la perte de poids. Les administrations intra-rectales seront réalisées sous anesthésie générale à l'isoflurane et le volume d'injection ne pourra dépasser 200 μL. L’endoscopie sera réalisée sous anesthésie.
Impact des rythmes de croissance sur l’activité des cellules souches musculaires chez la truite arc en ciel
Choix de l'espèce
La truite arc-en-ciel (Oncorhynchus mykiss) est une espèce robuste dont l’élevage, la croissance et la reproduction sont bien maîtrisés en pisciculture. Il s’agit d’une espèce d’intérêt agronomique puisqu’elle représente 95% de la production française piscicole en eau douce. Elle est par ailleurs un modèle biologique largement diffusé dans la communauté scientifique (environ 50 000 références). C’est une espèce avec une très grande plasticité de croissance. Cette espèce n'est pas incluse dans la liste des espèces identifiées comme devant provenir d’élevage ou de fournisseurs agréés. Nous allons utiliser des poissons de 5g à 250g car c'est durant cette période que la croissance est exponentielle et avec la plus grande plasticité. Par ailleurs, pour évaluer l’effet sur la qualité du produit (texture), il faut des poissons d'un poids minimal de 250g, qui correspond à la taille commerciale « portion ».
procédures
Après avoir été marqués à l'aide d'une puce magnétique (procédure 3, modérée), les animaux seront soumis à une restriction alimentaire (procédure 1) ou à un jeûne d'une semaine (procédure 2) afin de ralentir leur croissance. Nous utiliserons 200 poissons dans la première procédure et 100 poissons dans la deuxième (1 semaine de jeûne). Les prélèvements qui seront réalisés seront faits après euthanasie à dose létale.
Impact sur les animaux
Certains animaux vont être soit nourris 2 jours par semaine (lundi et jeudi) soit privés de nourriture pendant 7 jours maximum ce qui va engendrer une sensation modérée de faim pendant au maximum 5-7 jours par semaine. Pour les animaux nourris à 80% de la satiété et à satiété aucune nuisance n'est attendue.
A l'issue de chaque procédure, pour réaliser des prélèvements de muscle, les animaux seront euthanasiés à dose létale par une personne compétente désignée par les responsables de projet. Les responsables du bien-être des animaux sont bien sûr informés.
Objectifs
En fonction de la température et de la disponibilité en eau, les pisciculteurs adaptent leurs pratiques en réduisant fortement le nourrissage pour assurer la survie des animaux et maîtriser l’impact environnemental de leur production. Ces pratiques ont pour conséquences d’altérer le rythme de croissance des animaux.
Bénéfices attendus
Dans le cadre de ce projet, nous pourrons déterminer si les rythmes de croissance au cours de la phase exponentielle de croissance affectent l'activité des cellules myogéniques et le nombre de fibres musculaires qui sont déterminantes pour le potentiel de croissance ultérieure. Par ailleurs, cette connaissance permettra de faire des recommandations aux pisciculteurs quant à la gestion des rythmes de croissance dans leur élevage.
Remplacement
L'objectif du projet étant de déterminer l'impact des rythmes de croissance sur la plasticité des cellules souches, cela implique nécessairement de réaliser des tests sur animaux vivants.
Réduction
Pour Réduire le nombre d'animaux utilisés, nous allons utiliser des bacs avec un volume modulable pour maintenir une densité optimale (entre 5 et 20kg/m3) et un effectif de 100 poissons/bac pour éviter les comportements agressifs. Avec cette quantité, nous pouvons prélever 15 poissons à chaque prélèvement ce qui est suffisant pour atteindre les objectifs scientifiques de l'étude et détecter des différences de plasticité des cellules souches musculaires.
Raffinement
Les animaux seront élevés dans un environnement optimal pour l’espèce (photopériode, qualité d’eau, densité, enrichissement). Les paramètres physico-chimiques de l’eau (température, O2, NH4+) seront également régulièrement contrôlés. Les manipulations sont réalisées par du personnel compétent le plus rapidement possible pour limiter le stress.
Développement par imagerie d’une méthode d’expression de protéines bioluminescentes via l’injection de vecteur ADN dans les cellules musculaires de la souris
Choix de l'espèce
Le présent projet vise à développer, grâce à l’imagerie, une méthode permettant de faire exprimer par un muscle un anticorps ou fragment d’anticorps à partir d’un plasmide contenant leur gène. La souris est une espèce animale très largement employée dans la littérature pour ce genre d’étude de par la relative faible durée des expérimentations (quelques semaines), ainsi que par la possibilité d'utiliser des techniques d'imagerie in vivo. C'est ainsi le modèle animal de choix. La méthode mise en place dans ce projet a pour vocation de faire produire notre anticorps d’intérêt dans un système complètement fonctionnel et développé. Les animaux employés seront donc adultes, entre 7 et 10 semaines au moment de l'arrivée des animaux et leur entrée dans le protocole.
procédures
Les souris de ce projet subiront au maximum : - 5 injections d’une durée total de 12 min (1 IM couplée ou non à l’électroporation, soit 10min ; 4 IP pour l’imagerie, soit 2 min) - 10 anesthésies à l’isoflurane pour une durée totale de 70 minutes (5 rasages, soit 10min ; 1 IM couplée ou non à l’électroporation, soit 10 min ; 4 imageries de bioluminescence, soit 50 minutes) - 2 à 5 prélèvements de sang sur souris vigile, soit 2 à 5min au total.
Impact sur les animaux
Les injections intramusculaires et l’application de courants électriques pour l’électroporation peuvent potentiellement induire des douleurs. Ils seront réalisés sous anesthésie générale. Une prise de sang au niveau submandibulaire sera également réalisée sur animaux vigiles dans les deux premières procédures. Les souris seront suivies grâce à nos grilles de scoring pour surveiller l’apparition de signes de souffrance tel que la perte de poids, la modification de la physiologie ou du comportement (dont la locomotion suite à l’injection intramusculaire avec ou sans électroporation). Nous utiliserons des souris immunodéficientes qui sont à phénotype dommageable car elles présentent une absence de défenses immunitaires efficaces. Si elles sont contaminées par des bactéries et/ou virus, cela entrainerait leur décès. Elles seront donc hébergées en portoir ventilé où il y a une très haute protection contre ces agents pathogènes empêchant ainsi l’expression de ce phénotype. Ce statut est également garanti durant les différentes séances d’imageries durant lesquelles des procédures strictes sont respectées (désinfection du matériel, entretien des locaux, ordre de passage des souris dans l’imageur…).
mise à mort de tous les animaux à la fin de chaque procédure pour prélèvements post-mortem.
Objectifs
Le présent projet vise à développer, grâce à l’imagerie, une méthode permettant de faire exprimer par un muscle un anticorps ou fragment d’anticorps à partir d’un plasmide contenant leur gène. Le plasmide est injecté dans les cellules musculaires de souris afin d’induire une sécrétion à une dose supérieure ou égale à la dose minimale efficace de l’anticorps. L'objectif est donc double : 1/ mettre en place une méthode d’expression d‘anticorps par les cellules musculaires 2/ induire une expression qui soit suffisante pour être détectée dans le sang des animaux et agir sur des cibles présentes à distance des muscles sécréteurs. Ce projet fait suite à de nombreux tests cellulaires de vérification de la fonctionnalité des plasmides ADN utilisés. Sa réussite ouvrira la voie à des études plus approfondies et à visée thérapeutique chez des espèces domestiques. En bref, nous aurons une preuve de concept de l’utilisation de vecteurs ADN injectés dans les muscles des animaux, qui fonctionneront alors comme des « usines de production » d’anticorps dirigés contre des cibles. La niche d’utilisation de cette stratégie clinique concerne les maladies chroniques, dans notre cas, les maladies chroniques inflammatoires articulaires (ex : arthrite) et cutanées (ex : psoriasis ou pelade).
Bénéfices attendus
Une fois abouti, le présent projet a pour vocation de mettre en place une méthode de production de biomédicament par les cellules musculaires de souris via l’injection d’un vecteur ADN. Celle-ci ouvrira de nombreuses perspectives thérapeutiques et vétérinaires.
Remplacement
Une première sélection des meilleurs plasmides d’expression a été réalisée en amont par nos collaborateurs par des études in vitro. L’étude de la production d’un anticorps ou d’une protéine recombinante par un tissu musculaire et sa sécrétion dans la circulation sanguine générale n’a pas de méthode alternative que l’utilisation d’animaux vivants à l’heure actuelle.
Réduction
Nos protocoles expérimentaux ont été mis en place de sorte à Réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés en injectant des vecteurs exprimant des protéines bioluminescentes, qu’il est possible de suivre par imagerie de bioluminescence et par luminométrie. Le suivi par bioluminescence in vivo permettra de suivre l’expression de la luciférase au cours du temps sur un seul et même animal et d’éviter de multiplier les groupes. C’est donc un double bénéfice au niveau scientifique et au niveau de l’utilisation d’animaux. Le nombre d’animaux utilisés dans ce projet est réduit au minimum sans toutefois compromettre les objectifs. Sur 5 ans, nous prévoyons l’utilisation au maximum de 180 souris qui seront réparties ainsi : - Mise en place des protocoles de transfert de vecteur ADN au sein de notre laboratoire : 40 souris - Étude du contrôle du système immunitaire : 40 souris - Étude des méthodes de transfert du vecteur ADN dans les cellules musculaires en utilisant soit différents polymères, soit différents produits de transfection : 100 souris.
Raffinement
La modalité d'imagerie mise en œuvre est non invasive et est réalisée sous anesthésie gazeuse. Les injections intramusculaires sont également effectuées sous anesthésie gazeuse. Le matériel stérile à usage unique adapté aux rongeurs, ce qui limite le risque d’infection et la douleur infligés au cours de l'expérimentation. Enfin, les souris auront 1 semaine minimum d’acclimatation avant le début de l’expérimentation. Elles seront 2 à 6 souris maximum par cage de 530 cm² selon leur poids. Ces cages seront en portoir ventilé, ce qui empêchera l’expression du phénotype dommageable des souris immunodéficientes. Ce statut est également garanti durant les différentes séances d’imageries durant lesquelles des procédures strictes sont respectées (désinfection du matériel, entretien des locaux, ordre de passage des souris dans l’imageur…). Les souris immunocompétentes seront également hébergées en portoir ventilé. Les cages sont enrichies avec du matériel pour la fabrication d’un nid et des granulés pour ronger et jouer avec ses congénères. Elles auront un accès à l’eau et la nourriture ad libitum et un cycle jour/nuit 12h/12h pendant toute la durée de l’expérimentation. Des grilles de scoring avec des points limites prédictifs seront mis en place et le personnel assurera l’observation des animaux quotidiennement afin d'anticiper leur souffrance. Néanmoins, en cas de douleur observée en post injection du plasmide, une injection sous-cutanée d’un analgésique) sera effectuée. Une injection intramusculaire peut provoquer une douleur liée à un hématome. Pour les prises de sang, un crayon hémostatique sera appliqué à la fin du prélèvement afin d’arrêter le saignement.