Depuis 2021, les États membres de l’Union européenne doivent publier sous un format standardisé les résumés non techniques (RNT) des projets d’expérimentation animale autorisés sur leur territoire. Le système européen ALURES est exclusivement en anglais et ne permet pas de filtrer par degré de gravité ou devenir des animaux après les expériences. Je regroupe donc régulièrement ici les RNT français pour en faciliter l’exploration et la compréhension d’ensemble.
Dernière mise à jour : 01/10/2024
RNT (FR) 2013-2021
Jusqu’en 2021, le ministère de la Recherche publiait sur son site web des résumés très succincts des projets approuvés par ses soins, compilés dans des fichiers PDF peu maniables. Regroupés par année, ces fichiers sont téléchargeables ci-dessous.
Résumés des projets approuvés depuis 2022
Légende
Souffrances : sans réveil (▲), légères (▲), modérées (▲), sévères (▲).
Devenir prévisionnel des animaux : adoption (), élevage (), réutilisation (), non précisé ().
Rôle des voies de réponse aux défauts de l’homéostasie protéique dans la réponse aux traitements de chimiothérapie dans des modèles murins de cancers MSI (Instabilité des MicroSatellites)
Choix de l'espèce
Justification de l’espèce : Les souris sont des animaux modifiables génétiquement et qui montrent de grandes similarités en termes de mécanismes moléculaires et cellulaires avec l'homme. Pour notre projet, l'utilisation des modèles murins est la seule approche permettant d'intégrer le développement tumoral MSI et la complexité de la réponse aux traitements de chimiothérapie. Justification des stades : Les études se feront avec des animaux adultes. Les animaux impliqués dans la mise au point des traitements seront des animaux commerciaux utilisées à partir de 8 semaines de vie. Nous avons choisi cet âge pour tester la toxicité du traitement sur des animaux relativement jeunes afin d’envisager pour la dose un traitement préventif si besoin. Les modèles animaux qui développent des tumeurs spontanément rentreront dans le protocole de traitements à partir d’environs 8-10 semaines. Les souris auront alors atteint un poids et une taille favorable pour pouvoir bien supporter le traitement de chimiothérapie. De plus, grâce à notre expérience de ces modèles, nous savons que l’âge moyenne d’apparition des signes cliniques liés au développement de la pathologie est de 180 jours, ainsi la mise en œuvre d’un traitement à partir de 8-10 semaines nous permettra d’évaluer l’efficacité d’un traitement curatif ainsi que préventif.
procédures
Les modèles murins transgéniques utilisés développent spontanément des cancers dit MSI pour microsatellites instables (lymphome et adénocarcinome) dans la première année de vie. Les animaux recevront un régime riche en gras à raison de 2 semaines par mois et retrouveront un régime classique les 2 semaines suivantes tout au long du projet. Les animaux recevront différents traitements par injections intrapéritonéales sur animal vigile à raison de 5 injections par mois pendant maximum 8 mois (soit 40 injections maximum). Dès l’apparition de signes évocateurs du développement d’une tumeur, les animaux seront euthanasiés par une méthode réglementaire afin de réaliser les différents prélèvements pour répondre à la question scientifique.
Impact sur les animaux
Les modèles murins transgéniques utilisés développent spontanément des cancers dit MSI pour microsatellites instables (lymphome et adénocarcinome) dans la première année de vie. Les effets indésirables sont donc principalement liés à ce développement tumoral. Les principaux symptômes du lymphome sont une augmentation de la taille des organes comme la rate, le thymus et le foie ainsi que dans certains cas des ganglions qui se manifeste généralement par une prise de volume au niveau abdominale/cou. Pour l’adénocarcinome intestinal, il s’agit d’une tumeur qui reste localisé et n’envahi pas les tissus/organes à distance (pas de métastase). Les souris dans ce contexte peuvent faire des occlusions intestinales qui se manifeste généralement par un amaigrissement. L’alternance entre régime standard et régime riche en gras pourra induire un léger stress en raison du changement d’alimentation (néophobie de la souris). L’administration des différents traitements par injection intrapéritonéale pourront induire un stress et une douleur de courte durée lié à la piqure de l’aiguille. Les traitements devraient Réduire les effets liés au développement tumorale (lymphome et adénocarcinome) avec de possibles effets secondaires mais qui semblent très limités.
À la fin de l’étude, tous les animaux seront euthanasiés selon des méthodes réglementaires adaptée afin de prélever des tissus pour analyse. Une partie des animaux ne seront pas analysés puisqu’ils seront euthanasiés dans le cadre de l’entretien de la lignée.
Objectifs
Les cancers MSI (pour microsatellites instables), sont des tumeurs fréquentes, présentant des niveaux élevés de mutations notamment dans des séquences répétées microsatellites. Ces tumeurs sont caractérisées par la perte de l’activité du système de réparation de l’ADN appelée MMR (pour MisMatch Repair). Dans ce type de tumeurs, nous avons rapporté l’effet d’une mutation dans un gène codant pour une protéine dont le rôle est de protéger la cellule d’agressions et stress. La mutation de ce gène présente dans 25 pourcents des tumeurs des patients atteint de cancer MSI, affaiblis la cellule tumorale, tandis que son absence est associée à une résistance des tumeurs aux traitements de chimiothérapie. Avec ce projet nous voulons trouver une nouvelle piste thérapeutique pour les patients atteints de cancer MSI qui présente une mutation dans ce gène et qui donc est résistante à la chimiothérapie. Nous espérons expliquer comment les cellules tumorales utilisent cette protéine pour se défendre des dommages induits par les agents de chimiothérapie. Dans ce projet, nous testerons l'hypothèse selon laquelle la perte de fonction de la protéine influence la sensibilité des cellules tumorales aux chimiothérapies via la modulation de l'activité métabolique de la cellule. D’un point de vue fondamentale ce projet vise à améliorer nos connaissances des mécanismes de résistance à la chimiothérapie de certaines cellules tumorales. D’un point de vue clinique ce projet ouvre à terme des nouvelles pistes thérapeutiques pour le traitement de patients atteints de cancers coliques de type MSI.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra d’élucider dans un point de vue fondamentale et clinique, le rôle du métabolisme dans la réponse à la chimiothérapie des patients atteints de cancers coliques de type MSI (pour Microsatellites instables). Les cancers MSI (pour microsatellites instables), sont des tumeurs fréquentes, présentant des niveaux élevés de mutations notamment dans des séquences répétées microsatellites. Ces tumeurs sont caractérisées par la perte de l’activité du système de réparation de l’ADN appelée MMR (pour MisMatch Repair). Des préliminaires montrent que dans environs 75 pourcents de ces types de tumeurs, le métabolisme et la protéostasie c’est-à-dire la biogenèse, le repliement, le trafic et la dégradation des protéines, seraient associé à une mauvaise réponse au traitement de chimiothérapie et ceci via une protéine spécifique que nous étudions ici. Les résultats que nous obtiendrons ouvriront à terme des nouvelles pistes thérapeutiques pour ce type de cancer
Remplacement
La mise en œuvre de ce projet n’est aujourd’hui possible que grâce à l’obtention préalable de données in vitro. A ce stade de nos recherches, il est important tester notre hypothèse sur un modèle in vivo afin d’ouvrir à terme une nouvelle piste thérapeutique. Il n’est pas possible de recréer in vitro la complexité d’un organisme entier avec tous les acteurs cellulaires rentrant en jeu. Dans le cas d’un projet qui vise à étudier l’effet d’une nouvelle molécule et l’implication du métabolisme dans la réponse à la chimiothérapie, il est nécessaire de travailler sur un modèle in vivo car mieux adaptés à l'observation des effets globaux sur un sujet vivant et en particulier pour ce qui concerne l’initiation et la progression tumoral ainsi que les effets autres qui pourraient se manifester sur l’organisme.
Réduction
Le projet impliquera un total de 384 animaux. Nous limitons au maximum le nombre d’animaux par groupe de façon à obtenir des résultats statistiquement fiables. A cause des variabilités inter-animales et intergroupes, un nombre trop restreint d’animaux engendrerait des résultats trop variables et non valides. Compte tenu des données de la littérature (variabilité attendue) et des effets espérés, un test de puissance statistique a été utilisé pour déterminer le nombre minimum d’animaux nécessaire pour cette étude. Les procédures expérimentales ont été affinées pour éviter l'utilisation inutile de souris. En effet, en se basant sur les données de la littérature nous avons choisi de mettre en une étude séquentielle afin de Réduire le nombre d’animaux utilisés. Dans un premier temps, un premier lot d’animaux sera inclus pour définir la concentration optimale des traitements. Dans un second temps, nous évaluerons l’impact de ces traitements à leur concentration optimale sur nos modèles transgéniques. Cette stratégie permettant de Réduire significativement le nombre d’animaux impliqués. De plus, l’utilisation de la stratégie du riche en gras de manière alterné permet d’accroitre la fréquence du développement de l’un des types de tumeur qui nous intéresse, ce qui permet de Réduire la taille des groupes à 20 souris. Il apparait nécessaire de mettre en observation 20 souris par groupe pour espérer mettre en évidence un impact significatif du traitement dans le cadre de notre expérience en restant respectueux de la règle des 3R. Nous utiliserons différents tests statistiques pour l’interprétation fiable de nos résultats.
Raffinement
Dans la réalisation de ce projet, l’ensemble des procédures a été mise au point afin de permettre une interprétation fiable dans le respect du bien-être animal, en limitant la douleur et le stress. Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation, les animaux disposent de nourriture et d’eau ad libitum. Le milieu est enrichi à l’aide de coton de nidification ou de maison de type igloo. Nous nous efforçons à chaque instant de Raffiner nos procédures afin de garantir le bien-être des animaux en cours de procédure grâce à une surveillance attentive (point limite). Les contraintes induites par le manipulateur dans ce protocole sont faibles (uniquement l’injection des traitements). Elles sont réalisées par du personnel formé et compétent et avec du matériel adapté en condition stérile. Durant les phases de traitement la surveillance sera augmentée afin de mettre en évidence toute intolérance liée au traitement. Un suivi pondéral des animaux sera réalisé afin de mettre en évidence une éventuelle perte/prise de poids. La principale douleur pouvant être subit par les animaux concerne surtout le développement naturel des tumeurs. Ainsi, grâce au suivi et à la très bonne connaissance des modèles murins utilisés, nous pouvons détecter les premiers signes d’un développement tumoral. Dans ce cas, les souris seront immédiatement euthanasiées.
Etude des causes précoces des problèmes de communication à l’intérieur de la cellule dans le foie chez la souris obèse diabétique.
Choix de l'espèce
Le modèle souris est utilisé car leur physiologie est similaire à celle de l’homme pour le contrôle de la glycémie. Des souris de 8 semaines à 6 mois seront utilisées pour le maintien de la lignée. Des souris âgées de 5 semaines sont utilisées car quand il s’agit de les nourrir avec une alimentation obésogène, les effets métaboliques sont plus marqués si débutée rapidement après le sevrage.
procédures
- Prélèvement d’un bout d’oreille pour le génotypage (2838 souris vigiles – 1 fois – quelques secondes). - Périodes de jeûne : avant le test métabolique pour mesurer la sensiblité au glucose un jeûne de 6 heures sera réalisés (1 fois par souris sur 288 souris vigiles), un jeûne de 12 heures sera réalisé à la fin de l’étude pour mesurer la glycémie à jeun (1 fois par souris sur 288 souris vigiles). - Prélèvements sanguins : prélèvements à la queue d’une goutte de sang sur des souris vigiles pour mesurer la glycémie (7 fois par souris, sans contention, durée 30 sec, souris vigiles, 288 souris) + 1 prélèvement avant la mise à mort sous anesthésie (1min) (288 souris). - Injections : 1 injection de glucose sur des animaux vigiles, durant environ 30 secondes avec la contention (288 souris). - Régime alimentaire : Une alimentation obésogène pendant 9 jours (288 souris).
Impact sur les animaux
Au cours des procédures, les souris pourraient subir les effets suivants : - Douleur transitoire au moment du prélèvement du bout d’oreille (1mm). - Effets du jeûne : Une sensation de faim et une hypoglycémie après 12h de jeûne, pouvant causer du stress et une baisse d'activité, les conduisant à rester dans leur nid. - Douleur transitoire au moment des prélèvements de sang pour la glycémie - Douleur transitoire à l’injection : Une légère douleur au point d'injection du glucose.
Tous les animaux de ce projet seront mis à mort afin de prélever les organes d’intérêt pour répondre aux questions scientifiques.
Objectifs
L'obésité et le diabète de type 2 sont des problèmes de santé majeurs, souvent causés par une glycémie élevée, une résistance à l'insuline et un foie gras. La communication de structures à l'intérieur des cellules perturbe le métabolisme des sucres et des graisses, ce qui contribue à l'hyperglycémie. Chez les souris, cette défaillance de communication apparaît rapidement après seulement une semaine de suralimentation, avant même que les problèmes métaboliques ne se manifestent, suggérant qu'elle joue un rôle causal. Les mécanismes précis restent inconnus. Ce projet de recherche va permettre d’identifier les mécanismes de l’apparition du foie gras en utilisant des approches a large échelled dans un modèle de souris génétiquement modifié. L'objectif ultime est de trouver de nouvelles cibles thérapeutiques pour restaurer la communication dans la cellule, traiter les troubles métaboliques du foie et rétablir un bon contrôle de la glycémie chez les personnes obèses et diabétiques de type 2.
Bénéfices attendus
L'objectif de ce projet de recherche est de découvrir un nouveau mécanisme qui contrôle la glycémie et de trouver des moyens de prévenir et/ou traiter le diabète de type 2. Si ces idées sont confirmées chez la souris, des tests chez l'homme seront effectués.
Remplacement
Ce projet vise à compléter les données obtenues en laboratoire sur des cellules de foie. Ce projet permet d’aller plus loin en démontrant la régulation de ces nouveaux mécanismes à l’intérieur des cellules dans le foie après un repas, essentielle pour un contrôle optimal de la glycémie. Il s'agit donc d'une étude de physiologie intégrée, pour laquelle il n'existe pas d'alternative non animale.
Réduction
Pour Réduire le nombre d'animaux utilisés, le nombre de souris est calculé avec précision pour offrir la puissance statistique nécessaire à l'interprétation des résultats. Étant donné la variabilité des paramètres mesurés entre les souris, un minimum de 18 souris par groupe est requis. Dans un souci de Réduction nous utiliserons les souris mâles et les souris femelles. Réduction du nombre d'accouplements et ralentissement de la production lorsque les animaux ne sont pas nécessaires pour les expériences.
Raffinement
- Avoir une phase d’acclimatation pour habituer les animaux à la présence de l’expérimentateur (odeurs, voix, etc) pour diminuer leur stress face aux humains. - Les injections seront réalisées par une personne expérimentée afin de limiter la durée des gestes et ainsi le stress de l’animal. - Les volumes d’injection ont été réduits au maximum. - Une anesthésie sera réalisée pour les gestes douloureux. - La prise de poids et la prise alimentaire des souris seront contrôlées. - Des points limites suffisamment précis, prédictifs et précoces seront définis afin de mettre à mort tout animal le nécessitant et éviter toute souffrance des animaux. - Surveillance rapprochée (5 fois par semaine) par les expérimentateurs durant l'expérience.
Influence de la fréquence de prise alimentaire, pendant les périodes diurnes et nocturnes, sur les paramètres métaboliques de rats obèses.
Choix de l'espèce
Le rat Sprague Dawley développe une obésité sous régime hyper lipidique (5524cal/g) ce régime modélise plus fidèlement les apports caloriques actuels chez l’homme, sans pour autant induire de diabète de type 2. Il est également important de noter que des « sous-groupes » d’animaux apparaîtront au sein de ces animaux, en effet certains prendront du poids suite à la consommation du régime, alors que d’autres se maintiendront à un poids normal, présentant une résistance à l’induction de l’obésité par le régime. Pour ce projet, les changements métaboliques attendus (prise alimentaire, prise de poids, glycémie, insulinémie), les organes impliqués (intestin, cerveau, muscles, foie, tissus adipeux) et le fluide biologique (LCR) sont tels que nous sommes contraints d'avoir recours à un modèle préclinique proche des pathologies métaboliques humaines telles que l’obésité. Les rats Sprague Dawley arriveront à l’animalerie à l’âge de 3 semaines (jeunes sevrés), ils auront une semaine d’habituation à l’animalerie. Ils seront utilisés à l’âge de 4 semaines.Ils seront mis en cage individuellement pour obtenir une obésité juvénile avec prise de poids corporel et de masse grasse, ils seront soumis à deux régimes hyperlipidiques . Un autre groupe de rats du même âge auront une nourriture standard ad libitum. L’objectif est également de vérifier l’efficacité du TRF (Time Restricted Feeding), une approche diététique où l’apport calorique est réduit à quelques heures sans altérer l'apport quotidien en qualité ou en quantité de nutriments afin de lutter contre l’obésité et les troubles métaboliques. Pendant toute la durée de l’étude. Ils seront en cycle inversé et ils seront utilisés pour l’expérimentation à l’âge de 11 semaines.
procédures
De jeunes rats agés de 4 semaines seront soumis à un régime hyperlipidique pour induire une obésité et une insulino-résistance pendant 28 semaines. Les animaux subiront des prélèvements sanguins à la 11ème et 23 ème semaine de régime pendant le test de tolérance au glucose.
Impact sur les animaux
Un stress lié à l'isolement des animaux et un effet délétère à long terme qui peut survenirsur la masse et la force musculaire des rats soumis au régime hyperlipidique.
mise à mort pour prélèvements d'organes.
Objectifs
L’étude de la destructuration pathologique de l’organisation circadienne de l’organisme, se traduit à long terme par des troubles cliniques sévères (perturbations du sommeil, altérations métaboliques). Notre objectif principal va être d’étudier les voies par lesquelles les horloges principales et secondaires contrôlent la rythmicité des processus physiologique.
Bénéfices attendus
Ce projet s’inscrit dans le cadre de la recherche sur l’obésité et le diabète. La prévalence de l’obésité est en constante augmentation au niveau mondial (OMS), de même que les maladies qui lui sont associées (maladies cardiovasculaires, diabète...). Le concept de chronobésité, rattachée aux pathologies diabétiques et obésités, découle de l’hypothèse selon laquelle une désynchronisation chronique du cycle veille-sommeil et des rythmes circadiens (cycle d’environ 24 heures) favoriserait la surcharge lipidique. Les rythmes circadiens sont contrôlés par des oscillations moléculaires que l'on nomme "horloges". L'horloge circadienne principale se situe dans le cerveau, au niveau de l'hypothalamus, elle est synchronisée essentiellement par la lumière, mais également par d'autres facteurs (comportementaux, pharmacologiques ou nutritionnels). En plus de cette horloge principale, des horloges secondaires situées dans les organes périphériques (foie, tissus adipeux, coeur) interviennent également dans le contrôle des rythmes circadiens. Le rythme des prises alimentaires serait régulé par une horloge alimentaire, une meilleure connaissance de la synchronisation alimentaire ouvrira la voie à de nouvelles approches thérapeutiques permettant de corriger les anomalies circadiennes délétères liées aux pathologies métaboliques telles que l’obésité et le diabète. Elle permettrait également de prévenir les troubles métaboliques induits par les désynchronisations dues aux modes de vie actuels (travail de nuit, travail posté, décalage horaire). Les stratégies employées devraient mettre à profit l’effet synchroniseur d'une planification et d'une composition des repas optimisées. Pour mener à bien cette étude, les rats seront soumis à un cycle inversé de 12h/12h : 7h00-19h00 (période nocturne ou d’activité) et 19h00-7h00 (période diurne ou de repos) qui nous permettra d’étudier le rôle de l’horloge alimentaire sur l’impact des désordres métaboliques.
Remplacement
Dans le cadre de notre projet, nous devons avoir recours à un modèle animal pour mimer et pour mesurer les effets bénéfiques que l’on peut attendre d’un changement de pratique alimentaire telle que l’alimentation limitée dans le temps (TRF :Time Restricted Feeding). L’utilisation d‘un modèle animal est incontournable. En effet, ce type de projet ne peut en aucun cas être remplacé par des expériences in vitro. Nous avons besoin d’étudier des paramètres comportementaux et de physiologie intégrée qui implique les interactions entre les nombreux organes et que l’on ne peut pas modéliser in vitro.
Réduction
Cette étude ne peut être remplacée par d’autres moyens que les modèles animaux, car nous regardons les dialogues inter-organes avec comme résultante le taux de glucose sanguin, nous utiliserons le minimum de rats nécessaire en respectant le bien-être animal (Raffinement des procédures, amélioration de leur environnement). Le nombre d’animaux est minimisé et nous effectuerons les différentes expérimentations sur des mêmes groupes de rats tant que celles-ci se révèlent non invasives et peu douloureuses : IPGTT, ITT, PPT et GTT. Les animaux seront leur propre contrôle, cela nous permet ainsi de diminuer le nombre d’animaux utilisés. Dans le domaine de l'étude d’une désynchronisation des repas, un n de 30 est correct pour l'analyse statistique : Utilisation du test de Student et du test ANOVA. Il n’existe pas de modèles in vitro permettant ce type d’analyse. En vue d’appliquer les réglementations Européennes en termes de Réduction.
Raffinement
Le soin apporté aux animaux par le personnel animalier et les responsables du projet a pour but d’améliorer le bien-être des rats. De Réduire, supprimer ou soulager les douleurs. Les causes de souffrance et de stress pourraient provenir du régime alimentaire hyperlipidique ou de l’isolement. Le milieu de vie en cage d’hébergement est enrichi en bâtons de bois. Le suivi des animaux se fait individuellement (manipulation 5jours/7, suivi du poids corporel) tout au long de l’étude jusqu’à la mise à mort. Le mal être inattendue d’un animal est pris en charge selon les points limites établis et à une utilisation des procédures réglementaires et à la mise à mort. Ce suivi permet de valider les résultats scientifiques
Etude du rôle des récepteurs nucléaires orphelins au cours du développement préimplantatoire murin
Choix de l'espèce
La souris est un mammifère de petite taille à reproduction rapide qui partage 99% d’homologie avec le génome humain, d’où son intérêt majeur en recherche fondamentale sur le développement. En plus, des souris génétiquement modifiées existent déjà pour les gènes étudiés. Les souris femelles donneuses d’embryons sont des souris âgées de 3 à 12 semaines : la stimulation hormonale est efficace pour induire l’ovulation sur cette tranche d’âge.
procédures
Nous utiliserons la superovulation, une technique basée sur 2 injections consécutives d'hormones par voie intrapéritonéale, nécessitant l'immobilisation de l'animal pendant moins d’une minute, à 48 heures d'intervalle.
Impact sur les animaux
Les nuisances pour les animaux seront dues à deux injections d’hormones dans l’abdomen. Ces injections sont dénuées de tout effet nocif dans les conditions d’utilisation prévues. Néanmoins, elles peuvent entrainer une douleur, inconfort et stress de sévérité légère de courte durée sans impact sur la santé ou le bien-être animal.
Toutes les femelles seront mis à mort pour prélever des embryons.
Objectifs
L'objectif de ce projet est de clarifier les rôles joués par une classe de facteurs capables de contrôler l’expression de gènes, dans le développement de l’embryon de souris. Après la fécondation, les embryons de mammifères doivent générer rapidement tous les types de cellules nécessaires pour s'implanter dans l'utérus et se développer. Ce processus dépend de la mise en route de l’expression de gènes (en anglais: zygotic genome activation, abrévié ZGA), et sur la réinitialisation de l'état de l'ADN hérité des parents. Cette opération est nécessaire pour effacer l’origine parentale de l’ADN au début de la vie et comprend la nécessité de réparer et d'étendre les extrémités des molécules d'ADN, dans des régions connues sous le nom de télomères. Les récepteurs nucléaires ont été impliqués dans ce processus, mais il reste à prouver qu’ils ont un rôle essentiel. Une fois la ZGA achevée et après les deux premières divisions cellulaires, des cellules différenciées émergent et vont donner naissance au trophectoderme, qui formera une partie du placenta, l'endoderme primitif, qui contribue au sac vitellin, et l'épiblaste, qui génère tous les tissus constituant le corps adulte. Ce potentiel immense de l’épiblaste est qualifié de pluripotence. Nos travaux antérieurs in vitro sur des cellules embryonnaires souches, lignées cellulaires issues de l’embryon qui conservent le même potentiel immense de différenciation, ont montré que deux récepteurs nucléaires, sont ensemble indispensables au maintien de la pluripotence. Il est donc important de comprendre si l'acquisition de la pluripotence repose aussi dans le contexte du développement embryonnaire naturel sur l'activité de cette classe de gènes. Bien que les résultats publiés sur l’inactivation des gènes de récepteurs nucléaires ne montrent pas d’effet sur les premiers jours du développement, nous pensons que l'importance de ces gènes a été masquée par la capacité de l’embryon à compenser l’absence de l’un des gènes par un autre gène de la famille. En utilisant de souris génétiquement modifiées nous allons définir le rôle synergique de plusieurs récepteurs nucléaires dans la réinitialisation et l’activation du génome, la spécification de différents types cellulaires embryonnaires, et en particulier dans l’acquisition de la pluripotence. L'objectif principal de ce projet est donc de générer de nouvelles connaissances scientifiques.
Bénéfices attendus
Ce projet vise à comprendre le rôle d'une classe importante de gènes, les récepteurs nucléaires orphelins, dans la coordination des premiers jours du développement embryonnaire, qui aboutit à la formation entre autres d’une population de cellules capable de donner naissance à tous les types de cellules constituant le corps adulte. L’embryon permet d’obtenir des cellules qui peuvent être cultivées et maintenues en laboratoire in-vitro: les cellules souches embryonnaires, ou « ESCs ». Comme les cellules de l’embryon préimplantatoire, les ESCs sont aussi pluripotentes et capables de générer de nombreux types cellulaires. Cette propriété remarquable suscite beaucoup d’espoir dans le domaine médical dans le cadre de thérapies de Remplacement cellulaire. Une des retombées de nos travaux sur les embryons est d’identifier les conditions permettant de dériver des modèles cellulaires de type ESCs, mais plus immatures et donc possédant des potentialités accrues de différenciation. Ainsi, en plus de générer des connaissances de base pour mieux comprendre le développement embryonnaire de la souris, mais également d’autres mammifères, nos résultats pourraient faire progresser de manière significative notre capacité à utiliser les ESCs dans la clinique.
Remplacement
Nos travaux antérieurs ont largement utilisé les cellules en culture (ESCs) et ont permis d’identifier une classe de gènes, les récepteurs nucléaires orphelins, qui pourraient être impliqués dans les processus de différenciation cellulaire. Bien que l'étude in vitro des lignées de cellules pluripotentes présente un intérêt indéniable, ce modèle de différenciation ne récapitule pas complètement les mécanismes qui contrôlent la ségrégation des différents lignages embryonnaires, et les résultats obtenus en culture doivent être vérifiés et développés dans le contexte du développement naturel. C'est précisément pour ces raisons que nous devrons maintenant tester directement sur des animaux les conclusions de nos études précédentes.
Réduction
Notre travail est basé sur la comparaison entre des embryons témoins et des embryons porteurs de mutations dans différents gènes. Pour Réduire le nombre de souris femelles utilisées, nous avons : optimisé les croisements, de sorte que chaque femelle produit à la fois les embryons témoins et des embryons porteurs des mutations étudiées, dans les proportions désirées. Nous prévoyons aussi d'utiliser la superovulation, une technique permettant d'obtenir, à partir de chaque femelle 20-30 embryons. Nous chercherons également à utiliser le moins d'embryons possible pour chacune des approches expérimentales : Nous devrons évaluer l'expression des gènes dans les embryons et la capacité de l'ADN à être lié et modifié par des facteurs régulant le développement. Pour ces techniques basées sur le séquençage ADN, les exemples existants dans la littérature font souvent état de l'utilisation de centaines d'embryons par échantillon. Nos données préliminaires suggèrent que des données informatives sont obtenus à partir d'embryons uniques, bien que le bruit de fond et les effets de lot soient dans ce cas substantiels. Des améliorations techniques ont été implémentée, pour maximiser la reproductibilité, permettant l'utilisation de seulement 5 embryons par condition, répétée en 5 expériences indépendantes. Nous devrons également visualiser par microscopie la présence et la localisation des facteurs contrôlant la spécification et la prolifération de chaque type cellulaire de l’embryon précoce, ainsi que suivre les extrémités des molécules d'ADN présentes dans chaque cellule, les télomères, et les protéines actives à ces régions. Nous utiliserons aussi la microscopie pour mesurer les niveaux d'expression génique globaux, et ceux de gènes spécifiques. Pour analyser chacun de ces facteurs/gènes par microscopie, entre 5 et 10 embryons sont nécessaires, et les analyses doivent être répétées au moins 3 fois. Néanmoins, 3 marqueurs peuvent souvent être analysés sur chaque embryon en même temps. Nous veillerons donc à coupler la détection de plusieurs marqueurs par embryon, et nous analyserons le moins de marqueurs possible, tout en obtenant des résultats informatifs. Enfin, des modèles de culture cellulaire pourront nous aider à établir des priorités ou d'éliminer certaines sections expérimentales tout au long de l'exécution du projet.
Raffinement
Les souris concernées par cette demande sont les femelles donneuses d’embryons, sur lesquelles deux injections intrapéritonéales seront réalisées. Bien que ces injections ne soient pas dommageables, tous les efforts seront mis en place pour Réduire le plus possible toute souffrance et angoisse de l’animal. Pour cela, nous veillerons à ce que les animaux n'assistent pas aux injections d'autres individus, pour ne pas provoquer de stress avant la procédure. Nous immobiliserons les animaux avec précaution, et après qu'il se soient adaptés à la manipulation par l’expérimentateur.
Etude des mécanismes pro-arythmiques liés à une mutation responsable d’une maladie cardiaque héréditaire, la CPVT, lors de la réponse au stress dans un modèle murin
Choix de l'espèce
La souris constitue un bon modèle cardiovasculaire car c’est un rongeur possédant un cœur à 4 cavités et une physiologie semblable à l’être humain. De ce fait, cette espèce est la plus couramment utilisée comme modèle d'étude de la fonction cardiovasculaire. De plus, il a été démontré que nos protéines d’intérêt retrouvées chez l’être humain ont des fonctions similaires chez la souris. Ainsi, ces animaux représentent un bon modèle sur le plan physiologique et génétique. Des souris adultes âgées de plus de 4 mois seront utilisées car les maladies cardiaques se déclarent essentiellement à l’âge adulte et il a été montré que dans les modèles CPVT de souris, les arythmies surviennent majoritairement entre 4 et 6 mois.
procédures
Afin d'enregistrer le rythme cardiaque, les animaux sont placés sous anesthésie générale pendant environ 40 minutes pour permettre l’implantation sous-cutanée d’un capteur électrocardiogramme. Les animaux reçoivent une analgésie pré- et post-opératoire. Après implantation de ces capteurs les animaux ont une période de repos d’une semaine. On évaluera ensuite la réponse au stress par l'enregistrement du rythme cardiaque, lors de 5 protocoles successifs. La réponse au stress sera provoquée par un exercice physique (environ 30 minutes), puis des injections intrapéritonéales de substances pharmacologiques (3 protocoles différents donc 3 injections différentes ; durée d’effet moins d’une heure) sur animal conscient et par des épisodes de nuisances sonores de courte durée (bruit de sèche-cheveux, 15 secondes, répétées 5 fois). D’autres animaux seront étudiés par échocardiographie, sous anesthésie générale. C’est une technique d’étude non invasive, qui dure environ 30 minutes.
Impact sur les animaux
Afin d'enregistrer le rythme cardiaque, les animaux sont sujets à une implantation sous cutanée de capteurs. Cela peut entrainer une douleur dues aux sutures ainsi qu'un inconfort de l'animal. La durée de cette nuisance est de 4 semaines (1 semaine de repos après implantation et 1 semaine de protocole expérimental puis échelonnement des euthanasies). Les protocoles expérimentaux pendant l'enregistrement du rythme cardiaque induisent un stress chez l'animal qui est nécessaire à l’expérience (stress pharmacologique par injection intrapéritonéale unique, stress émotionnel par nuisance sonore de courte durée).
A la fin de chaque procédure, les animaux sont euthanasiés afin de collecter le cœur. Cela nous permettra d’étudier l’expression et l’activité de notre protéine mutée d’intérêt. Ces études permettront une meilleure compréhension des mécanismes impliqués dans notre domaine d’étude.
Objectifs
Les maladies cardiovasculaires sont la première cause de mortalité dans le monde. Parmi elles, les troubles du rythme sont une cause importante de mort subite. Ces troubles du rythme adviennent lors de conditions pathologiques telles que l’insuffisance cardiaque ou suite à des maladies génétiques par mutation d’une protéine impliquée dans le rythme cardiaque. Lors d’un stress aigu, les catécholamines naturellement produites par l’organisme entrainent une accélération du rythme cardiaque et une augmentation du débit de sang. Dans certaines maladies génétiques comme la CPVT (tachycardie ventriculaire polymorphe catécholergique), des mutations altèrent cette réponse au stress, causant des défaillances cardiaques allant parfois jusqu’à la mort subite. Dans les cellules cardiaques, le calcium constitue un élément essentiel à la régulation de la fréquence cardiaque. La CPVT est causée par une mutation d’un canal cardiaque pour le calcium, RYR2. L’objectif du projet est d’étudier les mécanismes impliqués dans les arythmies cardiaques en situation de stress sur des modèles de souris génétiquement modifiées qui miment cette maladie. Nous étudierons ainsi la réponse au stress de ces souris. Les souris mâles et femelles seront étudiées distinctement dans ce projet afin de déceler des différences potentielles basées sur le sexe.
Bénéfices attendus
Par ce projet, nous espérons mieux comprendre les mécanismes de régulation du canal au calcium RYR2 en réponse à un stress dans un contexte physiologique mais aussi dans un contexte pathologique. A court terme, il s’agit de mieux comprendre les mécanismes de cette maladie et à moyen terme, cela pourrait permettre de développer RYR2 comme une nouvelle cible thérapeutique. En effet, environ un tiers des patients atteints de tachycardie ventriculaire polymorphe catécholergique ne sont pas correctement pris en charge par les traitements actuels.
Remplacement
Au vu du niveau de complexité et de la spécialisation des cellules cardiaques, aucun système d’étude in vitro ne permet actuellement d’analyser la fonction et le dysfonctionnement cardiaque. Ainsi le recours à des modèles animaux reste impératif. Le cœur est un organe complexe, composé anatomiquement de plusieurs compartiments et physiologiquement de plusieurs tissus spécialisés. De plus, notre étude porte sur la réponse du cœur (et ses défauts) en fonction du stress, en conditions physiologique et pathologique, il est donc indispensable d’étudier le cœur intégré à l’organisme ; les modélisations par ordinateur ne sont pas suffisantes pour mimer une telle complexité. Il est donc nécessaire pour l’évaluation de la fonction cardiaque d’utiliser un mammifère entier adulte afin de s’approcher le plus possible des mécanismes physiopathologiques humains. La souris est un bon modèle car les gènes étudiés sont conservés.
Réduction
Une planification à l’aide de logiciels de statistiques nous a permis de déterminer le nombre d’animaux minimum nécessaires pour obtenir des résultats fiables, pour chaque objectif du projet. De plus, au sein d'une procédure expérimentale, les lots de souris sont soumis à diverses techniques d’études afin de Réduire le nombre d’animaux utilisés et maximiser le recueil de données sur les mêmes animaux. Afin d’utiliser au mieux les animaux à notre disposition issus des croisements de lignées, mâles et femelles seront étudiés. En fin d’expérimentation, les animaux seront euthanasiés et des expériences de biologie moléculaire et des études sur tissus ou cellules isolés seront effectuées afin d’optimiser les ressources à notre disposition et ainsi Réduire le nombre d’animaux utilisés.
Raffinement
Les animaux élevés au sein de l’animalerie seront pris en charge et observés de leur naissance à leur euthanasie. Les cages des animaux seront enrichies et les animaux seront suivis par un personnel spécifiquement formé. Les animaux seront hébergés en groupes sociaux stables formés d’individus compatibles, dans une pièce où les paramètres environnementaux (température, hygrométrie, lumière) et sanitaires sont contrôlés. Les interventions chirurgicales se font sous anesthésie générale et les animaux reçoivent une analgésie pré- et post-opératoire. Les souris feront l’objet d’une surveillance quotidienne et de pesées régulières en fonction des procédures. Une grille de score a été définie, évaluant les paramètres suivants : apparence, comportement naturel, hydratation, signes cliniques et comportement provoqué. Des points limites, en fonction du score obtenu selon cette grille, ont été décidés, menant à l’administration d’analgésie supplémentaire ou à l’euthanasie.
Etude de la biocompatibilité des dispositifs médicaux (DM) sur la santé humaine par l’utilisation d’un modèle de lapin.
Choix de l'espèce
L’espèce et le stade de développement des animaux à utilisé est imposé par la normes ISO 10993-23. Le choix d’une autre espèce doit être justifié. Pour la totalité des projets présentés, nous utilisons des lapins jeunes adultes de 9 à 15 semaines. Si des femelles sont utilisées elles doivent être nullipares et non gravides.
procédures
* Tolérance cutannée : Un traitement local (maximum 24h) sur 3 animaux vigiles. En fonction du projet le traitement peut être répétés, la durée peut varier. Deux pesées. Observations macroscopiques tous les jours jusqu’à la fin de l’étude. euthanasie (1minute). *Tolérance intradermique : Un traitement (5minutes) sur 3 animaux vigiles. Deux pesées. Observations macroscopiques tous les jours. euthanasie (1minute). *Tolérance oculaire : Analgésie (30 sec) au début de l'étude et si besoin pendant le déroulé du projet. Un traitement local dans le sac conjonctival sur 3 animaux vigiles (1minute). Deux Pesées. Observations macroscopiques tous les jours, nécessitant un colorant (2minutes). euthanasie (1minute). * Tolérance sur muqueuse vaginale et anale : Traitements vaginaux quotidien (espacés de 24h) sur 6 (traitement d’un produit pur) ou 12 (traitement par extrait) animaux vigiles. Les animaux restent sur le portoir de contention entre 10 et 20 minutes selon le nombre d’animaux à traiter. Deuxpesées. Observations macroscopiques tous les jours. La durée de l’étude et le nombre de traitement peut varier en fonction du projet. euthanasie (1minute). Autopsie et prélèvement des organes.
Impact sur les animaux
*Tolérance cutanée : les réactions attendues sont locales, limitées à la zone de traitement. Il peut y avoir une sécheresse cutanée, une perte de souplesse de la peau, un érythème pouvant aller jusqu’à la formation d’escarre et/ou de croûte, une destruction de l’épidermes et du derme, et de l’œdème. Les effets observés peuvent restés jusqu’à la fin de l’étude, soit 14 jours. *Tolérance oculaire : les réactions attendues sont locales, limitées à la zone de traitement. Il peut y avoir du larmoiment, de l’œdème, des conjonctives, de l’érythème, une atteinte cornéenne (opacitée, néovascularisation, œdème cornéen), une atteinte de l’iris. Les effets observés peuvent restés jusqu’à la fin de l’étude, soit 21 jours. * Tolérance intradermique : les réactions attendues sont locales, limitées à la zone de traitement. Il peut y avoir un érythème pouvant aller jusqu’à la formation d’escarre et/ou de croûte et de l’œdème. Les effets observés peuvent restés jusqu’à la fin de l’étude, soit 3 jours. * Tolérance sur muqueuse vaginale et anale : les réactions attendues sont locales, limitées à la zone de traitement. Il peut y avoir un érythème, de l’œdème et des écoulements. Les effets observés peuvent restés jusqu’à la fin de l’étude, durée du traitement varie en fonction du projet. L'ensemble des procédures sont classées en modérées. Les animaux étant hébergés individuellement, ils ont un contact limité avec leurs congénères ce qui limite également l’expression de comportements grégaires (durée d'hébergement maximal: 7 semaines).
Concernant les tests de tolérance cutannée et oculaire, les lapins n’ayant pas présenté de signes d’irritation ou des signes très légers et uniquement sur les trois premiers jours d’observation peuvent être récupérés pour être réutilisés dans une autre procédure utilisant une voie d’administration différente. Ceci dans un souci d’éthique animale et de Réduction des animaux utilisés. Si les signes d’irritation observés sont plus importants, alors les animaux ne pourront être réutilisés car ils auront été traités avec une substance d’essai classée à minima irritante pour la peau. Dans ce cas là les animaux seront euthanasiés. Pour les tests de tolérance intradermiques, les animaux sont euthanasiés à la fin de l’étude. Les tests de tolérance sur muqueuse vaginale ou anale conduisent également à l’euthanasie des animaux puisque des analyses histopathologiques sont nécessaire à la conclusion de l’étude.
Objectifs
Les professionnels de santé utilisent aujourd’hui des dispositifs médicaux (prothèses, pansements, ovule, gel lubrifiant...) que nous appelons « DM ». Le but du projet est d’évaluer la biocompatibilité de ces dispositifs. Autrement dit nous devons déterminer si les dispositifs, qui vont avoir un contact direct avec les tissus et fluides interne, sont compatibles avec le corps humain. Parmi les paramètres à étudier pour évaluer la biocompatibilité d’un DM, il faut évaluer sa tolérance locale, autrement dit sa capacité à ne pas induire de réactions d’irritation. Afin de répondre aux obligations règlementaires avant mise sur le marché de produit, nous réaliserons sur le modèle du lapin des tests d’irritation cutanée, oculaire, vaginale, rectale, et intradermique. Cette évaluation est imposée par les instances règlementaire européennes.
Bénéfices attendus
Le projet permet d’obtenir des données expérimentales utilisées pour conclure sur la sécurité biologique d’un DM, autrement dit sa biocompatibilité. Ce projet fait partie intégrante de l’évaluation biologique des DM, une exigence essentielle en matière de sécurité requise par le Règlement Europpéen et exigée par les organismes notifiés afin d’accorder ou non la mise sur le marché. Le but est d’obtenir une autorisation de mise sur le marché de DM sans risque pour la santé de l’homme.
Remplacement
Pour l’ensemble des études de tolérance locale, tout matériau connu pour être irritant pour la peau, les yeux ou les muqueuses ou ayant un pH ≤ 2.0 ou ≥ 11.5 ne doit pas être testé. Dans des cas exceptionnels où une caractérisation/évaluation des risques est nécessaire malgré cela, ces cas doivent être justifiés et documentés. Par ailleurs, les tests d’irritation ne doivent être envisagés que si les données de sécurité ne peuvent pas être obtenues par d’autres moyens. A l’heure actuel un test in vitro est aujourd’hui accepté par les autorités règlementaires et peut être utilisé pour Remplacer certains tests in vivo. Ce test est également régi par la norme 10993-23 (+ adaptation de l’OCDE 439). Il permet d’évaluer la tolérance locale pour les extraits des DM en contact avec une peau saine et lésée. Néanmoins lorsque le dispositif est un mélange, un implantable long terme, permet une communication interne externe ou qu’il est en contact avec les muqueuses les tests in vivo seront toujours recommandés. Le test in vitro repose sur la mesure de la viabilité cellulaire à travers l’utilisation d’épiderme reconstruit. Ces épidermes sont constitués de plusieurs couches de cellules épidermiques et d’une couche cornée enfin de créer une véritable barrière cutanée qui pourrait donc s’apparenter à la peau. Pour mesurer cette viabilité nous utilisons un produit chimique qui va pénétrer dans les cellules vivantes et sera réduit par les mitochondries en sel bleu de formazan et donc donnera une couleur violette. La lecture de la viabilité se fait ensuite par mesure de densité optique. Aujourd’hui, aucun test in vitro n’est accepté par les autorités règlementaires pour évaluer l’effet irritant d’un dispositif médical sur les yeux (norme ISO 10993-23). Une veille technologique et scientifique est effectué régulièrement par le groupe afin de rester attentif à des avancés scientifique et parution de nouvelles normes qui permettrait d'utiliser des méthodes in vitro à la place de methode in vivo.
Réduction
Tolérance locale : Les animaux utilisés dans ces études peuvent être issus d’autres études de tolérance locale où ils ont été traités avec une autre voie d’administration. Cela n'est possible que lorsque aucun effet ou des effets très légers ont été observés. Les animaux utilisés dans ces études sont de sexe indifférent à l’exception de l’irritation vaginale qui est réalisée sur des femelles. Pour l’ensemble des projets lapins, nous ne faisons pas de témoins positifs afin de Réduire le nombre d’animaux utilisés. Les études précédentes présentant des scores nous servent de témoins. Le nombre d'animaux par étude est exigé par la norme ISO et le nombre de test annuel est basé sur une estimation au vue du nombre de test effectué les années précédentes. Aucun test statistique n'est utilisé dans ces projets.
Raffinement
A leur arrivée, les animaux sont mis en cage par l’animalier qui effectue un premier contrôle de leur état de santé. En vue de leur acclimatation aux conditions du laboratoire, les animaux sont gardés pendant au minimum 5 jours avant le début des procédures, dans des cages individuelles. La taille des cages est adaptée aux critères de bien être animal, elles sont équipées de plateformes, de cloisons transparentes, d’un fond perforé en noryl et un enrichissement par briquettes de bois est mis à leur disposition. S’il y a atteinte des points limites alors l’animal sera euthanasié pour raison éthique avant la fin de l’étude. Les points limites sont définis pour chacun des tests afin d’éviter toutes souffrance inutile aux animaux. Concernant le projet d’irritation oculaire, des analgésiques sont utilisés avant, pendant et après le traitement. L'analgésie continuera aussi longtemps que nécessaire. Les antalgiques ne sont possibles que pour les tests oculaires puisque ce sont les exigences de la norme utilisée.
Elevage de souris génétiquement altérées immunodéficientes dans un contexte de recherche en cancérologie.
Choix de l'espèce
Les animaux utilisés pour la recherche permettent d’étudier les maladies et leurs traitements sur des systèmes vivants comparables par de nombreux aspects au corps humain. La variété et la complexité des cancers, ainsi que leur incidence élevée, rendent l’utilisation de modèles animaux cruciale pour comprendre comment le cancer se développe (interactions entre les gènes et les facteurs environnementaux, mécanismes de croissance et de dissémination) et pour améliorer les stratégies préventives, diagnostiques et thérapeutique (amélioration des moyens de détection, développement de nouveaux traitements, adaptation du traitement au phénotype précis des tumeurs). Les souris reproductrices seront selectionnées à l'age de 8-10 semaines, elles seront mises en accouplement à l'âge adulte (8 semaines), stade qui correspond à leur maturité sexuelle pour une période de 6 mois. Le sevrage et le sexage seront réalisés entre 3 et 4 semaines. Les souris impliquées dans les projets entreront dans les procédures expérimentales à l'age de 5 à 12 semaines.
procédures
Change hebdomadaire de cage au moyen de pince stérile
Impact sur les animaux
Les souris NSG sont gravement immunodéficientes et sensibles à l'infection par un large éventail d'agents pathogènes normaux, d'agents pathogènes opportunistes et d'organismes commensaux.
L'élevage des souris NSG permettra d'inclure les souris produites en continue dans des projets de recherche permettant de mieux comprendre le développement des cancers et de trouver de nouvelles pistes de thérapie.
Objectifs
Les cancers sont une cause majeure de décès, derrière les maladies cardio-vasculaires.Ils représentent environ 13% de la mortalité mondiale. La croissance tumorale et la dissémination métastatique sont des processus très complexes et dynamiques dont les mécanismes ne sont pas encore compris dans leur entièreté. La recherche préclinique sur modèles animaux est aujourd’hui une étape indispensable pour améliorer notre compréhension de ces maladies et pour évaluer l’innocuité et l’efficacité des nouvelles thérapies. L’implantation orthotopique de cellules ou de tissus tumoraux permet de reproduire le plus fidèlement possible les mécanismes intervenant en pathologie humaine afin de pouvoir prédire l’efficacité clinique des nouvelles molécules anticancéreuses. A cette fin, notre plateforme d'élevage et d'expérimentation animale assure la production de souches de souris immunodéprimées (dont la souche NSG : NOD-SCID Gamma) qui facilitent la prise tumorale. Aussi, ce projet vise à décrire les procéssus de production et de soins apportés à l'élevage de cette souche de souris immunodéprimée impliquées dans les projets de recherche nécéssitant l'utilisation d'animaux de laboratoire et autorisées par le Ministère de l'Enseignement Supérieur.
Bénéfices attendus
La compréhension des mécanismes impliqués dans l'initiation au développement du cancer jusqu’à sa dissémination sous forme plus agressive (métastatique) permet d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques et visent à développer des approches innovantes ciblant les altérations de la cellule cancéreuse ou de son environnement dans le but de progresser vers de nouveaux traitements.
Remplacement
Pour la réalisation de ce projet, l’utilisation d’animaux vivants est indispensable car seul un animal vivant, entier, peut permettre d’étudier dans sa globalité la réponse immunitaire et l’effet des traitements sur la réponse anti tumorale, ainsi que les relations entre les différentes cellules dans un contexte physiologique ou pathologique. Cela est impossible à reproduire in vitro (dans des cultures de cellules) en raison de la complexité des interactions entre les différents types de cellules jouant un rôle dans le développement et la progression de la maladie
Réduction
Nous utiliserons le nombre minimum d’animaux requis pour atteindre l’objectif scientifique du projet, à savoir produire les souris NSG inclus dans les demandes d'autorisation de projet. Les besoins de production seront analysés tous les trimestres afin d'ajuster le nombre d'animaux au calendrier des procédures en cours d'exécution.
Raffinement
Les souris NSG sont gravement immunodéficientes et sensibles à l'infection par un large éventail d'agents pathogènes normaux, d'agents pathogènes opportunistes et d'organismes commensaux. Le maintien de souris NSG sans agents pathogènes est possible et réalisable par la mise en œuvre de pratiques de barrière strictes et d'une technique aseptique, pour garantir l'état de santé des souches NSG • Tous les aliments, eau, litière et cages entrant dans la pièce doivent être autoclavés ou stérilisés d'une manière ou d'une autre. • Microisolateur ou pressurisé en cage ventilé individuellement (PIV) est recommandé • L’acidification de l’eau à pH 2,5 – 3,0 contribue à prévenir l’infection par les espèces de Pseudomonas • L'équipement de protection individuelle (pâtelages stériles, rotules, gants, masques et couvre-cheveux) doit être porté à tout moment pour couvrir votre peau et minimiser les risques de propagation des bactéries aux souris. • Mordre les souris avec des pinces désinfectées, et/ou avec des mains gantées qui ont été stérilisées avec de l'éthanol • Changer de cage sous une hotte à circulation laminée. Désinfectez les mains après avoir ouvert le dessus de la cage ventilée, atteindre la cage ou retirer vos mains gantées de la cagoule. Désinfecter la hotte entre les changements • Dans un environnement de barrière strict, changements bihebdomadaires sont suffisants pour maintenir des souris saines. Cependant, les installations de recherche pourraient envisager de changer de cage chaque semaine pour empêcher l'introduction de doses minimales d'organismes opportunistes ou de plantes dans l'environnement de la cage • La queue enroulée, l'inclinaison de la tête et la boiterie des membres arrière sont observées à basse fréquence. Ces affections sont très peu fréquentes (incidence de 0,01 %) chez des souris jeunes, expérimentalement ou nées. L'incidence est estimée à plus de 0,5 % chez les souris plus âgées utilisées pour l'humanisation et d'autres études.
Etude du dialogue entre respiration et activité neuronale 1/2
Choix de l'espèce
Notre but est de comprendre les mécanismes impliqués dans l’interaction complexe entre cerveau-et respiration, à l’échelle de large ensemble neuronaux. Nous avons choisi le modèle souris car le cerveau murin présente de grandes similarités avec d’autres cerveaux de Mammifères, y compris l’Homme, et permet d’étudier les fonctions cognitives qui nous intéressent. L’influence de la respiration sur les fonctions cognitives a été montré aussi bien chez la souris que chez l’Homme ce qui appuie la pertinence de ce modèle. Le projet sera réalisé sur des animaux de 2-12 mois ce qui correspond chez cette espèce à l’âge adulte. Leur poids et leur taille sont stabilisés, et la taille du cerveau est homogène garantissant ainsi une bonne reproductibilité des sites d'injection et/ou d’implantation. L’utilisation de souris >6mois sera notamment réservée aux souris APP-PS1 qui développent un phénotype pathologique uniquement à partir de 3 mois chez les femelles et 6 mois chez les mâles.
procédures
Les souris seront étudiées lors de l’expression de comportements naturels et spontanés, lorsqu’elles dorment, mais aussi lors de courtes sessions où leur tête devra rester fixée face à un masque à oxygène. Afin de comprendre le fonctionnement du cerveau et son lieu avec la respiration, les souris seront équipés d’implants cérébraux qui permettent d’enregistrer l’activité de dizaines de neurones en cours de comportement. L’implantation de ces équipements et la réalisation de ces expériences nécessitent la réalisation de chirurgies (maximum 2 chirurgies par animal, durée 1-6h). Les enregistrements seront réalisés au maximum une fois par jour pour une durée de 2 heures environ (1h30 pour les expériences tête fixée). Au cours de certains enregistrements, nous ferons légèrement varier le taux d’oxygène présent dans l’atmosphère de la souris (variations
Impact sur les animaux
Pour pouvoir enregistrer l’activité des neurones dans les souris, nous utiliserons des électrodes très fines placées au préalable dans les régions cérébrales impliquées. La respiration sera enregistrée via une canule placée au niveau de la cavité nasale. Ceci nécessite la réalisation de chirurgies sous anesthésie et analgésie avec un impact très limité sur l’animal. Le port des implants suite à ces chirurgies peut générer une légère gêne pour l’animal. De plus, afin de contrôler le taux d’oxygénation des souris, nous devrons les placer dans une enceinte fermée dans laquelle l’atmosphère peut être contrôlée de manière précise. Dans une autre série d’expérience, il nous faudra maintenir la tête des souris au niveau d’un masque à oxygène, en réalisant une fixation de leur tête limitée dans la durée. La restriction des mouvements de l’animal pendant ces deux procédures ainsi que les variations de taux d’oxygénation peuvent être légèrement désagréables pour l’animal, tout du moins avant qu’il n’y soit y habitué. Enfin, nous prévoyons d’utiliser des souris modèles de la maladie d’Alzheimer qui parfois présentent des crises d’épilepsie et une mortalité accrue à partir de 4.5 mois.
L’euthanasie des animaux en fin d’expérimentation sera nécessaire pour prélever leur cerveau et faire l’analyse post-mortem des tissus cérébraux. Ceci concerne les souris dans lesquels des enregistrements valides auront été menés. Les souris pour lesquels la première chirurgie n’aurait pas fonctionné de par sa complexité (ex : canule nasale bouchée) ou les souris qui auraient atteint les points limites généraux seront euthanasiées.
Objectifs
La respiration est intimement liée à la physiologie du cerveau. D’une part, l’activité respiratoire est modulée par les stimuli sensoriels, par l’attention, l’état émotionnel et elle peut être affectée dans certaines pathologies du cerveau. D’autre part, la respiration impacte le fonctionnement cérébral, influençant la perception, les émotions et la cognition en général. Un grand nombre de neurones sensoriels situés dans la cavité nasale sont des mécanorécepteurs sensibles au flux d’air et transmettent le signal de respiration aux structures en aval, dont le bulbe olfactif et de nombreuses régions cérébrales. Ce signal est supposé jouer un rôle important dans la coordination des réseaux neuronaux et pourrait participer aux processus cognitifs dans les phases d’eveil mais aussi pendant le sommeil au cours duquel, entre autres, nous consolidons nos souvenirs. L’objectif général de ce projet est de comprendre la nature du dialogue entre respiration et activité neuronale et en particulier : 1- De comprendre comment la respiration, de par son activité rythmique, influence l’activité neuronale dans le système olfactif et les régions associées 2- De comprendre comment la respiration – de par son rôle dans l’oxygénation du cerveau - influence l’activité neuronale 3- De déterminer si le dialogue respiration-cerveau est identique dans plusieurs lignées de souris sauvages 4- De déterminer si le dialogue respiration-cerveau est déficient dans un modèle de maladie neurodégénérative 5- D’identifier des mécanismes de contrôle de la respiration par l’activité des neurones. Les résultats de cette étude pourront avoir un impact sur la santé humaine étant donné que la prévalence des apnées du sommeil dans la population et sachant que des problèmes de respiration ont été observés dans certaines pathologies (y compris la maladie d’Alzheimer).
Bénéfices attendus
Notre activité cérébrale est intimement liée à la façon dont nous respirons. La respiration module le fonctionnement cérébral (émotions, attention etc) et notre état cognitif régit en retour notre comportement respiratoire. Cependant les mécanismes impliqués dans ce dialogue sont peu connus. Cette étude apportera des éléments essentiels à la compréhension de cette question. Les résultats de cette étude pourront avoir un impact sur la santé étant donné que de nombreuses personnes souffrent d’apnées du sommeil et sachant que des problèmes de respiration ont été observés dans certaines pathologies humaines (dont la maladie d’Alzheimer).
Remplacement
La souris fait partie de la famille des Vertébrés, comme l’Homme, et elle est capable de fonctions cognitives relativement complexes : elle représente donc un modèle d’étude particulièrement intéressant pour comprendre le fonctionnement du cerveau humain. Nous étudierons les circuits neuronaux des souris alors que ces dernières effectueront des comportements naturels, interagissent avec leurs congénères, explorent, courent ou dorment : il nous faudra donc travailler avec des animaux vigiles. Par conséquent, il nous sera impossible de conduire cette étude in vitro. Enfin, dans l’état des connaissances actuelles, les questions que nous adressons ne peuvent malheureusement pas être réalisées in silico.
Réduction
Le nombre total d’animaux requis pour ce projet est 900 souris adultes sur 5 ans. Nous prévoyons de minimiser ce nombre en utilisant les mêmes souris pendant plusieurs sessions d’enregistrement, ceci donnant accès à un jeu de données riche. Enfin, nous utiliserons autant que possible des lignées consanguines ou congéniques pour limiter la variabilité liée la diversité allélique. Pour les expériences visant à tester l’impact de l’oxygénation sur le cerveau, avec différents taux d’oxygénation, une souris sera son propre contrôle car elle sera testée à différent taux d’oxygénation : ce qui augmentera notre puissance statistique et donc le nombre de souris nécessaires. Pour chaque condition testée, nous utiliserons le nombre minimum d’animaux nécessaire pour pouvoir tirer des conclusions valables sur le plan statistique et tenant compte des aléas liés à ces approches expérimentales complexes.
Raffinement
Nos souris seront hébergées en portoir ventilé, dans des conditions qui favorisent l’expression de leurs comportements naturels : petits groupes sociaux (maximum 5 souris par cage), cages enrichies d’éléments permettant de construire un nid (carré de coton, petites maisons en carton, frisures de papier kraft) ou de favoriser l’exploration (jouets). Les animaux seront acclimatés à leurs lieux d’hébergement/expérimentation et habitués de manière progressive aux procédures qu’ils vont rencontrer (notamment à la fixation de tête). Le bien-être de chaque animal sera évalué quotidiennement et une fiche de suivi individuel sera créée pour chaque procédure expérimentale. A partir des critères définis dans ces fiches, les expérimentateurs et techniciens animaliers seront informés des procédures à suivre pour limiter toute souffrance chez nos souris. L’utilisation de substances anesthésiques et analgésiques permettront de supprimer la souffrance des animaux lors des procédures qui le nécessitent. Lors des sessions d’enregistrement, les souris seront étudiées alors qu’elles expriment des comportements spontanés et naturels : elles seront exposées à des stimuli sensoriels différents de leur cage d’hébergement ce qui constituera, en soi, une forme régulière d’enrichissement.
Etude des circuits neuronaux impliqués dans la formation des mémoires émotionnelles pendant sommeil chez la souris
Choix de l'espèce
L’étude des mécanismes neurobiologiques des comportements complexes, comme le sommeil, nécessite l’utilisation d’animaux vivants. Le sommeil paradoxal est commun aux mammifères tels que la souris, le rat et l'homme, avec une organisation cérébrale similaire. Les modèles animaux alternatifs (drosophile, poisson zèbre, Caenorhabditis elegans), bien que populaires, n’ont pas de sommeil paradoxal et ne sont pas pertinents pour nos travaux. Depuis plus de 20 ans, les modèles de souris génétiquement modifiées ont fourni des résultats importants. L'utilisation de ces modèles pour étudier les circuits veille-sommeil est justifiée par la conservation de ces circuits chez les mammifères. Les résultats obtenus sont donc transposables au cerveau humain. En raison des ajustements souvent nécessaires dans les modèles transgéniques, nous utilisons une technique appelée transfection neuronale. Cette méthode consiste à introduire des gènes spécifiques dans les neurones (les cellules nerveuses du cerveau) en utilisant des virus modifiés, afin de mieux comprendre et modifier leur fonctionnement. Cette approche est reconnue comme très efficace pour étudier les fonctions cérébrales. Nous utiliserons des souris de souche standard et des souris transgéniques spécifiques (comme celles portant des gènes pour activer ou inhiber certains neurones) âgées de 10 à 12 semaines au début des procédures. À cet âge, les souris ont atteint leur maturité cérébrale, avec un système locomoteur et un cycle veille-sommeil stabilisés. De plus, l’efficacité de la transfection neuronale est maximale chez les souris jeunes adultes et diminue avec l’âge.
procédures
Tous les animaux (240 souris) subiront une intervention chirurgicale (1.5-2 heures) pour l'implantation permettant l'imagerie ou le contrôle optique des populations neuronales dans l'amygdale (neurones excitateurs ou inhibiteurs). Ils suivront ensuite un protocole d'habituation à la fixation de la tête pour l'imagerie à deux photons pendant le sommeil naturel ou aux câbles implantés de manière chronique (2 semaines). Ensuite, un groupe d'animaux (40 souris) subira un processus d'imagerie des populations neuronales de l'amygdale pendant le sommeil immédiatement après un protocole de conditionnement de la peur (durée totale de la procédure: 25 jours). Un deuxième groupe (80 souris) suivra un protocole de contrôle optique d'une sous-population neuronale dans l'amygdale suite à une tâche de conditionnement de la peur (durée totale de la procédure: : 25 jours). Enfin, un troisième groupe subira un protocole de génération de phénotypes comportementaux de TSPT et l'activité de l'amygdale de ces souris sera soit imagée (40 souris) soit contrôlée optiquement pendant le sommeil pour restaurer les performances comportementales normales des animaux (durée totale de la procédure: : 25 jours).
Impact sur les animaux
Les désagréments possibles sont les suivants : 1. Stress lié au génotypage : Lorsqu'on prélève un petit morceau de la queue pour analyser l'ADN, il peut y avoir un léger saignement. Pour y remédier, nous utilisons du tissu hémostatique et désinfectons la zone. 2. Stress dû à l'isolement : Les souris peuvent ressentir du stress et développer des comportements répétitifs lorsqu'elles sont isolées. Pour y remédier, nous enrichissons leur environnement. 3. Stress léger lié aux manipulations : Lorsque les souris sont manipulées par les chercheurs, elles ressentent un stress léger. Cependant, elles s'habituent rapidement à ces manipulations. 4. Complications chirurgicales : Lors des chirurgies, des gonflements, inflammations ou saignements peuvent survenir. Nous utilisons des médicaments spécifiques pour prévenir ces problèmes et appliquons du tissu hémostatique pour contrôler les saignements. 5. Inconfort au réveil après anesthésie : Après les chirurgies, les souris peuvent ressentir un inconfort. Toutefois, grâce à un protocole efficace de médicaments antidouleur et anti-inflammatoires, elles récupèrent rapidement. 6. Gêne liée à l'implant : Les premiers jours après l'installation d'un implant, les souris peuvent ressentir une gêne. Cependant, elles s'y habituent en quelques jours, et au bout de 5 jours, la plupart des souris retrouvent un comportement normal. 7. Perturbations dues à la fixation de la tête : Lors de la fixation de la tête, nous suivons un protocole pour minimiser le stress. En général, les souris retrouvent un cycle de sommeil normal après 5 à 6 jours. 8. Perturbation du sommeil par la lumière : Pendant les expériences d'optogénétique, la lumière utilisée peut perturber le sommeil des souris. Pour Réduire cela, nous recouvrons la zone avec un vernis noir pour minimiser les réveils. 9. Perturbations dues au conditionnement à la peur : Lors du conditionnement à la peur, une seule séance de courte durée (12 minutes maximum) est réalisée, avec 5 à 10 chocs électriques légers pour induire une réponse de peur durable.
Tous les animaux de la procédure expérimentale subiront le processus d’euthanasie pour collecter et préserver les tissus cérébraux afin de réaliser des études d’anatomopathologie et d’immunohistochimie à la fin du deuxième jour de l'expérience.
Objectifs
Le cerveau relie les informations importantes de notre environnement aux émotions que nous ressentons, ce qui renforce nos souvenirs et facilite leur rappel au bon moment. Ce processus se déroule à la fois lorsque nous sommes éveillés et pendant le sommeil, notamment pendant le sommeil paradoxal (ou sommeil REM). Pendant la journée, nos expériences émotionnelles sont enregistrées, puis consolidées pendant le sommeil. Ce traitement peut Réduire l'impact émotionnel de certains souvenirs, d'où l'expression "la nuit porte conseil". Améliorer la qualité du sommeil réduit l'anxiété, le stress et la dépression, tout en augmentant la satisfaction de vie. Les troubles du sommeil paradoxal sont souvent liés à des problèmes émotionnels comme le trouble de stress post-traumatique (TSPT). Ce projet vise à comprendre comment le sommeil stabilise les souvenirs émotionnels et à explorer de nouvelles pistes pour traiter les souvenirs traumatisants. Nous étudierons le cerveau de souris en utilisant des techniques d'imagerie avancées et en observant leur sommeil pendant des tâches émotionnelles, en nous concentrant sur l'amygdale, une région clé pour les émotions souvent impliquée dans des troubles comme le TSPT.
Bénéfices attendus
Ces dernières années, la France a traversé des périodes difficiles qui ont entraîné une augmentation des troubles psychologiques, notamment le trouble de stress post-traumatique (TSPT). Les attentats terroristes ont laissé des séquelles profondes, non seulement chez les personnes directement touchées, mais aussi dans l'ensemble de la population. Environ 20 % des médecins ayant soigné des victimes d'attentats montrent des symptômes de TSPT. Plus récemment, la pandémie de COVID-19 et le confinement ont aussi augmenté les troubles psychologiques, y compris le TSPT. Le sommeil est crucial pour la santé et la qualité de vie. En France, environ quatre millions de personnes souffrent d'insomnie sévère. Le sommeil aide à apprendre et à consolider les souvenirs. Manquer de sommeil affecte notre capacité à nous concentrer et à retenir des informations. Ce projet vise à comprendre comment le cerveau retient les souvenirs pendant le sommeil et pourquoi certaines personnes, comme celles atteintes de TSPT, ont des difficultés avec leurs souvenirs émotionnels. Nous nous concentrerons sur l'amygdale, une partie du cerveau importante pour les émotions, souvent liée à des problèmes de sommeil.
Remplacement
Bien que des animaux plus simples comme la drosophile, le poisson rouge ou le ver C. elegans soient parfois utilisés pour étudier l'activité du sommeil, ils n'ont pas de sommeil paradoxal, une phase spécifique que l'on trouve chez les mammifères et les oiseaux (et peut-être chez les reptiles). Leur système nerveux est beaucoup moins complexe que celui des mammifères, et donc pas comparable pour comprendre des processus neurologiques complexes. De nouvelles méthodes, comme la modélisation informatique, l'intelligence artificielle, les cultures cellulaires sur puce ou les organoïdes cérébraux, sont prometteuses mais ne remplacent pas encore la souris pour analyser et comprendre les dysfonctionnements du cerveau ou reproduire des observations cliniques liées à des pathologies neurologiques. Notre recherche vise à comprendre comment le sommeil est régulé et ses fonctions sur la physiologie et la cognition. Pour cela, nous avons besoin d'utiliser des animaux vivants et en bonne santé. Les techniques utilisées pour étudier les réseaux neuronaux et les mécanismes complexes ne peuvent pas être appliquées chez l'homme, car elles nécessitent des interventions invasives et des modifications génétiques ciblées, possibles uniquement chez la souris. Dans ce contexte, l'utilisation de la souris reste essentielle pour mener des études physiologiques et comportementales sur le long terme.
Réduction
Les expériences ont été conçues pour utiliser le moins d'animaux possible tout en garantissant des résultats fiables. Pour chaque type d'expérience, nous avons calculé le nombre d'animaux nécessaires, en prévoyant une petite marge pour les pertes éventuelles. Par exemple, pour les expériences d'imagerie à 2 photons, nous prévoyons un groupe de 10 animaux, en incluant une marge pour une perte possible de 20 %. Ces calculs sont basés sur des méthodes statistiques reconnues, qui nous aident à déterminer la taille minimale des groupes tout en maintenant la fiabilité des résultats. Une fois les données collectées, elles seront analysées à l'aide de tests statistiques, pour vérifier que les résultats sont significatifs et fiables.
Raffinement
Le projet a été conçu pour minimiser la douleur et le stress des animaux. hébergement et soins : Les souris seront logées à quatre par cage pour favoriser leurs interactions sociales et Réduire le stress. Elles auront un environnement enrichi pour leur bien-être. Après la chirurgie, elles seront placées par deux dans des cages doubles avec un séparateur pour qu'elles puissent interagir sans se nuire. Elles seront surveillées quotidiennement pour s'assurer de leur bonne récupération, avec des ajustements comme des analgésiques si nécessaire. Lorsque l'isolement est nécessaire, nous leur fournirons des matériaux pour construire un nid et ajouterons de nouveaux objets régulièrement pour stimuler leur environnement. Le stress affecte le sommeil, donc nous surveillerons leur comportement et leur sommeil avec des enregistrements polysomnographiques, qui permettent de suivre les cycles de sommeil et les signes de stress. Chirurgie : Toutes les procédures chirurgicales, y compris l'anesthésie et l'analgésie, sont réalisées selon les meilleures pratiques pour minimiser la douleur. L’état général des animaux sera surveillé quotidiennement. Une grille de notation (0 : meilleur état à 2 : état dégradé) évaluera leur état général en se basant sur plusieurs critères tels que le poids, la mobilité, la préparation du nid et l’état du pelage. Si le score atteint ou dépasse 4 pendant 3 jours consécutifs, ou si l’état des animaux se détériore malgré les soins après 7 jours, les animaux seront retirés de l’étude.
Etude de la dépendance du genre à la restriction potassique chez la souris.
Choix de l'espèce
L’intérêt d’utiliser des souris est que nous possédons des résultats préliminaires chez cette espèce. De plus les modèles transgéniques que nous voulons étudier existent chez la souris et nous les élevons à l’animalerie. Nous utiliserons des souris adultes mâles et femelles « normales » (dites sauvages) et transgéniques âgées de 8 à 16 semaines. L’âge adulte est nécessaire pour que la néphrogénèse (développement du rein) soit totalement terminée.
procédures
Au cours de ce projet, nous réaliserons 5 prélèvements urinaires en cages à métabolisme sur animal vigile au cours de 2 sessions en cage spécifique. La première session en cage métabolique implique un hébergement individuel de 72h à raison de 48h d’habituation et 24h pour le recueil. La seconde session dure 96h correspondants à 4 fois 24h pour 4 recueils. Les animaux ont accès à l’eau et l’alimentation en continue dans ces cages. Nous effectuerons 7 mesures de la composition corporelle en fluides (masse grasse, masse maigre et eau libre) en utilisant un appareil de résonance magnétique nucléaire dédié à ces mesures . Cette technique est non invasive et n’induit aucune douleur chez l’animal. L’animal est placé délicatement dans un petit tube qui restreint ces mouvements, le tube est placé dans l’équipement de mesures durant 2 minutes, puis l’animal est sorti du tube et replacé dans sa cage. Nous réaliserons également 2 prélèvements sanguins de faible volume réalisés sur des animaux anesthésiés et analgésiés : les 2 prélèvements seront espacés d’environ 11 jours, le geste dure 1min/animal. Enfin, les animaux seront euthanasiés sous anesthésie et analgésie au cours d’une chirurgie sans réveil (15 minutes).
Impact sur les animaux
Les effets indésirables des interventions sont connus car déjà testés chez l’animal. Le régime carencé en potassium est normalement bien toléré. La mise en cage à métabolisme peut entrainer un stress chez l’animal, par le fait qu’elle restreint légèrement la liberté de mouvement des souris et qu’elle impose un hébergement individuel des animaux . Leur structure rend l’ hébergement peu confortable sur une grille. La mesure de Kalièmie nécessite un prélèvement sanguin qui sera fait sous anesthésie et qui peut entrainer une hémorragie. Les risques liés à l’anesthésie sont à prendre en compte, comme par exemple, la survenue d’une l’hypothermie. Certaines souris seront placées dans un tube clos pour la mesure de la composition corporelle par mesure de résonance nucléaire magnétique. Cette procédure peut entraîner un léger stress au moment de la manipulation des souris pour vider leur vessie par massage abdominale et le temps de la mesure (2 minutes ).
A la fin de chaque procédure , tous les animaux de la procédure seront euthanasiés par une méthode réglementaire sous anesthésie et analgésie. L'euthanasie des animaux est requise en raison des prélèvements d'organes nécessaire pour répondre à la question scientifique.
Objectifs
Au-cours de l’évolution, nous avons considérablement changé nos habitudes alimentaires passant d’un régime riche en potassium et pauvre en sel à un régime (dit régime occidental) diamétralement opposé. Nous sommes actuellement très loin des recommandations de l’organisme mondial de la santé concernant les apports nutritionnels en sodium et potassium. Heureusement nos reins sont là pour nous aider à faire face à ces changements. Cependant, à long terme cette alimentation peut contribuer au développement de maladie comme l’hypertension et être corrélée à un risque accru de mortalité. Il est bien connu que le manque de potassium dans l’alimentation va induire une adaptation :1) le muscle peut relarguer du potassium contribuant rapidement à la modulation du potassium plasmatique et 2) le rein va diminuer sa sécrétion de potassium dans les urines et augmenter sa réabsorption vers le sang. Deux protéines essentielles à l’adaptation à un régime dépourvu de potassium ont été mise ne évidence : un transporteur rénal spécifique et un facteur de croissance,. L’ensemble de ces études ont été réalisé chez le mâle. Cependant une étude récente montre une différence d’adaptation à un régime carencé en potassium entre des souris mâles et femelles. Notre projet vise à comparer l’adaptation rénale de souris mâles et femelles à la restriction en potassium, et en comprendre les différences. L’ensemble des études seront réalisées chez des souris mâles et femelles sauvages ou n’exprimant pas le transporteur rénal spécifique ou le facteur de croissance .
Bénéfices attendus
La prévalence de l'hypertension artérielles est très élevées dans nos populations avec une différence notoire entre les hommes et les femmes (36 pourcents contre 25.2 pourcents - Bulletin Epidémiologique Hebdomadaire, 2018). Notre étude est un projet original de recherche fondamentale dans le domaine de la physiologie et physiopathologie rénale. Du point de vue des animaux, les résultats permettront de mettre en œuvre un des aspects des 3R, à savoir la Réduction puisque nous pourrons associer les femelles de nos élevages à nos expériences. Du point de vue bénéfice humain, les résultats nous permettront de peut-être envisager une prise en charge différente des hypokaliémies féminines. Nos recherches désigneront des protéines importantes, potentielles cibles thérapeutiques, qui pourraient être différentes chez les hommes et les femmes.
Remplacement
Notre projet vise à comparer l’adaptation rénale de souris mâles et femelles à la restriction en potassium. Cette adaptation met en jeu différents organes qui vont interagir les uns avec les autres via différents stimuli (messages hormonaux, humoraux…). L’analyse d’une telle complexité nécessite de travailler sur des organismes vivants entiers (ici des souris).
Réduction
Pour les procédures mise en œuvre, le nombre de souris par groupe sera de 12 animaux pour une procédure et 14 animaux pour l'autre. Il y aura 6 groupes par procédure soit un total de 156 animaux. La taille des effectifs a été établie grâce à un calcul de puissance. Ce chiffre correspond au nombre de souris nécessaires afin de mettre en œuvre les analyses statistiques pour une interprétation fiable des résultats. Dans la mesure du possible, un même animal sera utilisé pour la mesure de plusieurs paramètres comme décrit dans les différentes procédures.
Raffinement
Les procédures de Raffinement mises en place sont les suivantes : 1) 5 souris maximum par cages en portoir ventilé, dans des conditions d’hébergement conforme à la réglementation en vigueur pour l’espèce concernée 2) Libre accès à l’eau et la nourriture sous forme de croquettes (en hébergement individuel, la nourriture sera en poudre et déposée dans la mangeoire adéquate), 3) enrichissement par nids végétaux et/ou tunnels en carton ou plastique dans les cages et/ou buchettes en peuplier de taille moyenne, sans traitement chimique et autoclavable (les animaux peuvent les ronger, les déplacer…). Lors du passage en hébergement individuel, étape indispensable pour avoir accès aux métabolites urinaires et à la fonction rénale, les cages sont placées côte à côte afin que les animaux gardent un contact visuel, auditif et olfactif. Nous placerons une petite coupelle en verre de 6 cm de diamètre et de 1cm de hauteur de bord dans la cage qui servira de nid à la souris. Nous avons, au préalable, vérifier que la majorité des souris s’installent dans cette coupelle pour dormir et que cela ne change pas les recueils d’urine ou de fèces. Pour la mesure dans l’appareil à résonnance magnétique nucléaire, les animaux seront habitués à être manipulés et à être placés dans le tube de mesure. Les mesures de kaliémie seront réalisées sous anesthésie totale . L’expérimentateur qui fera ces prélèvements a plus de 10 ans d’expérience. Pour le prélèvement de leurs reins, les animaux subiront une anesthésie sans réveil, avec analgésie. L’ensemble des expériences sera mené par des personnels hautement qualifiés et formés à l’expérimentation animale et à la chirurgie.
Recrutement, différenciation et rôle des LysoDCs des plaques de Peyer
Choix de l'espèce
Le modèle murin est le modèle idéal pour étudier les cellules immunitaires de plaques de Peyer puisque c'est le modèle dans lequel elles ont été le mieux caractérisées. Il permet aussi d'étudier les réponses immunitaires spécifiques d'antigènes modèles utilisés dans le cadre de ce projet et d'analyser précisément les populations immunitaires et leur état d'activation grâce au grand nombre d'anticorps disponibles sur le marché pour cette espèce. Enfin, son infection orale par Salmonella Typhimurium est connue pour mimer une infection systémique par les salmonelles chez l’homme et est donc idéale pour tester l’efficacité vaccinale dans un modèle préclinique. Afin de limiter les variations expérimentales qui seraient dues à des différences d'âge et de poids, des souris adultes âgées de 7 à 12 semaines et pesant entre 20 et 30g seront utilisées.
procédures
1/ Injection de substances une seule fois/animal en moins d'une minute sur animal anesthésié légérement. 2/Administration de substances une à cinq fois par semaine pendant une semaine sur animal vigile. 3/ Chirurgie pratiquée en une seule fois en moins de 5 minutes sur animal anesthésié profondément. 4/ Gavages sur souris vigiles réalisés en moins d'une minute une à 5 fois par semaine pendant 2 semaines maximum. 5/ Prélèvement sanguin pratiqué une seule fois sur souris vigile en moins d'une minute.
Impact sur les animaux
Les prélèvements sanguins et les administrations de substances peuvent entrainer des douleurs légéres de courte durée. La toxine injectée est susceptible d'engendrer une diarhée de courte durée (
Tous les animaux seront euthanasiés à la fin de chaque procédure et les tissus d'intérêt prélevés en vue d'analyses.
Objectifs
Les plaques de Peyer sont des organes immunitaires se trouvant dans l'intestin grêle et responsables de l'initiation de la réponse immunitaire intestinale. Il existe une population de cellules immunitaires particulière dans les plaques de Peyer de plusieurs espèces dont la souris et l'homme qui sont très importantes pour la capture des agents pathogènes se trouvant dans la lumière intestinale. Cependant, leur origine, les facteurs nécessaires à leur survie et leurs fonctions dans l'initiation de la réponse immunitaire in vivo restent peu caractérisées. Nos objectifs visent à (i) identifier les précurseurs de ces cellules immunitaires dans le sang et la moelle osseuse ; (ii) caractériser les facteurs nécessaires à leur recrutement, leur survie et leur différentiation dans les plaques de Peyer ainsi que les cellules produisant ces facteurs dans leur microenvironnement ; (iii) étudier leurs fonctions in vivo grâce à des inhibiteurs et modèles de souris génétiquement modifiées ciblant spécifiquement ces précurseurs et facteurs. Ce projet fournira donc des données scientifiques essentielles sur les cellules immunitaires de plaques de Peyer et leur rôle dans l'initiation de la réponse immunitaire intestinale, ce qui devrait permettre d'influer sur ces réponses et proposer de nouvelles pistes d'investigation à visée vaccinale ou thérapeutique.
Bénéfices attendus
En fournissant des outils et des données scientifiques essentielles sur les cellules immunitaires de plaques de Peyer et leur rôle dans l'initiation de la réponse immunitaire intestinale, ce projet permettra d'identifier de nouvelles pistes d'investigation pour promouvoir ou réguler ces réponses immunitaires dans un but vaccinal ou thérapeutique. Il pourrait également permettre d'établir un premier modèle de culture in vitro des cellules immunitaires de plaques de Peyer concernées afin de Réduire l'utilisation des animaux jusqu'à présent indispensable à leur étude.
Remplacement
Aucun modèle de différentiation in vitro des cellules immunitaires de plaques de Peyer concernées n'existe actuellement. Il est donc impossible de les étudier sans avoir recours à l'expérimentation animale. Par contre, ce projet est susceptible de générer un tel modèle en identifiant les précurseurs et facteurs requis à la différentiation des cellules immunitaires de plaques de Peyer.
Réduction
Le projet est organisé de façon à Réduire au strict nécessaire le nombre de tests et donc de souris utilisées. Le nombre estimé de souris nécessaires à ce projet (1281) a été calculé afin d’obtenir une puissance statistique d'au moins 80% avec une erreur de première espèce de 5%.
Raffinement
Afin de limiter leur stress, les souris seront acclimatées à leur nouvel environnement pendant une semaine avant toute expérimentation. Elles seront hébergées par 5 dans des cages de 530 cm² avec la nourriture et l’eau fournies à volonté. Des dômes et du papier seront mis à disposition dans chaque cage pour enrichir le milieu. La température, l’hygrométrie et la photopériode de l’animalerie sont contrôlées et régulées. Nous essaierons autant que possible de Remplacer le gavage par une administration des molécules en solution appétente (lait sucré) à la micropipette après période d'habituation. Lors des expériences d’infection par les salmonelles sur les animaux vaccinés, le poids et l’apparition des symptômes de la salmonellose seront suivis quotidiennement en fin de journée afin de respecter le cycle de sommeil de la souris. Une grille de score dédiée définissant les points limites sera appliquée. De la nourriture en pâte sera aussi fournie directement dans la cage pour aider à l'alimentation des animaux affaiblis. Suivant les cas des mesures complémentaires seront prises en concertation avec le vétérinaire.
Mise en évidence du rôle des projections glutamatergiques et dopaminergiques mésocorticales dans le déclin cognitif lié à l’âge dans un modèle murin.
Choix de l'espèce
Ce projet vise à étudier comment certaines connexions cérébrales influencent le déclin mental lié à l'âge et si les activer directement peut y remédier. Nous utiliserons des souris génétiquement modifiées pour cibler ces connexions spécifiques. Notre modèle de souris est particulièrement pertinent car il permet d'étudier les changements cognitifs liés à l'âge de manière précise. Nous diviserons les souris en quatre groupes pour différentes manipulations. Nous comparerons les performances de souris adultes (3 à 6 mois) et âgées (18 à 22 mois) dans des tests de flexibilité cognitive. Pour comprendre à quel âge surviennent les changements cognitifs, nous inclurons également des souris d'âge moyen (10 à 13 mois). Ainsi, notre étude couvrira trois stades de développement différents. En fonction des résultats obtenus pendant la tâche cognitive, nous sélectionnerons deux groupes d’âge avec les différences de performance les plus marquées pour des manipulations supplémentaires, incluant des techniques anatomiques et optogénétiques spécifiques. Cela nous permettra d'approfondir notre compréhension des mécanismes neuronaux impliqués dans le vieillissement cognitif.
procédures
La plupart de souris (N=554) subira une chirurgie au niveau de leur cerveau pour soit injecter un virus (afin de cibler des groupes spécifiques de neurones), soit injecter une substance toxique (pour léser une partie du cerveau), soit implanter une fibre optique. Ces chirurgies seront réalisées sous anesthésie générale et avec une analgésie appropriée. Ensuite, toutes les souris (N=712) devront accomplir une tâche visuelle dans une boîte conçue spécialement pour cette expérience. Après la tâche comportementale, toutes les souris (N=712) seront euthanasiées par une méthode réglementaire effectuée sous anesthésie et analgésie.
Impact sur les animaux
La chirurgie entraîne un risque de douleur et de déshydratation pour les animaux, ainsi qu'un risque de perte de poids qui peut encore se présenter. Pendant la chirurgie, les animaux seront anesthésiés, ce qui comporte un risque de douleur, d'hypothermie, d'arrêt cardio-respiratoire, de déshydratation et d'yeux secs. Après la chirurgie, les souris auront soit des points de suture sur le dessur de leur tête, soit une fibre optique implantée, À la fois après la chirurgie et pendant la tâche comportementale, l'animal vivra à hébergement individuel. Cela peut causer du stress pour l'animal, car les souris sont des animaux sociaux et préfèrent vivre en groupe. De plus, pendant la tâche comportementale, les animaux ne sont pas soumis à une restriction alimentaire, mais pour obtenir de la nourriture, ils doivent accomplir la tâche.
Tous les animaux seront euthanasiés à la fin de l'expérience car les tissus cérébraux doivent être préservés pour une analyse ultérieure.
Objectifs
La prévention du déclin cognitif dans une population où les gens vivent de plus en plus longtemps est un défi majeur de santé publique. Le déclin cognitif lié à l'âge avancé est associé à une diminution de la flexibilité et du contrôle adaptatif du comportement. Les principaux objectifs de ce projet consistent à élucider les mécanismes de la détérioration de la cognition avec l'âge, et à tester diverses approches pour la ralentir dans un modèle murin. À cette fin, nous étudions les projections neuronales, connues pour être impliquées dans le déclin cognitif. Les études seront menées sur des souris adultes, d'âge moyen et âgées.
Bénéfices attendus
Au cours des deux dernières décennies, l'espérance de vie a augmenté de plus de six ans, principalement en raison d'une baisse des taux de mortalité plutôt que d'une prolongation des années vécues sans handicap. Par conséquent, améliorer la qualité de vie des personnes âgées est devenu un défi majeur en matière de santé, nécessitant une compréhension approfondie de la biologie du vieillissement. De plus, le taux de vieillissement cognitif sain varie considérablement entre les individus, ce qui soulève la question: pourquoi certaines personnes montrent-elles des signes de déclin cognitif plus tôt que d'autres? Cette variabilité est un axe majeur des recherches actuelles et constitue la base de ce projet. Ce projet vise à caractériser le rôle des différentes projections neuronales dans la flexibilité cognitive et la variabilité des performances comportementales chez les individus en fonction du sexe et de l'âge, dans un modèle murin. Comprendre ces mécanismes aidera à expliquer pourquoi certains individus maintiennent une flexibilité cognitive tandis que d'autres subissent un déclin plus prononcé. De plus, cette recherche explore la possibilité d'améliorer la flexibilité cognitive chez les animaux âgés par le biais de la stimulation ciblée des projections neuronales. Si ces interventions s'avèrent efficaces, elles pourraient ouvrir la voie à de nouvelles stratégies thérapeutiques pour améliorer la santé cognitive chez les personnes âgées.
Remplacement
Le modèle murin est crucial pour notre projet car il offre des avantages uniques qui ne peuvent être remplacés. Nous devons étudier le fonctionnement du cerveau dans des situations complexes impliquant le comportement et l'activité des neurones. Ce sont des aspects que nous ne pouvons pas pleinement comprendre en étudiant simplement des cellules en culture ou en utilisant d'autres méthodes ne faisant pas intervenir un animal vivant. Ainsi, l'utilisation des souris nous permet d'explorer à la fois la biologie du cerveau et son impact sur le comportement de manière détaillée et complète.
Réduction
Nous utilisons des boîtes automatisées, ce qui est une stratégie clé pour Réduire le nombre d'animaux nécessaires à l'expérience. Ces systèmes automatisés permettent de recueillir un volume important de données (des milliers d'essais par animal), dans une période de temps relativement court. En maximisant les informations recueillies auprès de chaque sujet, l'étude atteint un niveau plus élevé de puissance statistique, réduisant ainsi le nombre d'animaux nécessaires pour obtenir des résultats statistiquement fiables. De plus, des tests statistiques rigoureux sont employés pour garantir la fiabilité et la validité des données, contribuant à la Réduction du nombre d'animaux nécessaires tout en maintenant la rigueur scientifique. En tenant compte de l'expérience précédente en laboratoire et de la signification statistique, le nombre total d'animaux nécessaire est 712.
Raffinement
Après leur arrivée dans l'animalerie, les animaux provenant de l’extérieur bénéficieront d'une période d'acclimatation d'au moins 5 jours. Pendant la tâche comportementale, les animaux résideront dans une cage non standard avec du matériel de nidification approprié et de l'eau à volonté. Ils auront également accès à la nourriture à tout moment, mais devront effectuer une tâche visuelle pour l'obtenir (il n'y a pas de limite au nombre de fois qu'ils peuvent le faire). L'accès constant à la tâche comportementale servira d'enrichissement supplémentaire. Cette approche réduira le besoin de manipulation directe par l'expérimentateur, minimisant ainsi le stress potentiel pour les animaux. À tout autre moment, les animaux seront hébergés dans des cages standard avec enrichissement, alimentation et abreuvement à volonté. Les animaux seront surveillés quotidiennement par le personnel qualifié de l’animalerie et/ou les expérimentateurs. Toute procédure chirurgicale nécessaire sera effectuée avec le plus grand soin pour le bien-être des animaux, en utilisant une anesthésie générale appropriée et en administrant des analgésiques avant et après l'intervention pour leur confort. Une signalétique spécifique sera utilisée pour les animaux en expérimentation, permettant une surveillance adaptée en fonction des points limites définis à chaque étape de la procédure pour garantir leur bien-être. Des critères d'arrêt ou des points limites ont été déterminés pour chaque étape de la procédure expérimentale.