Relation entre DPP3, hématopoïèse et cellules issues de la moelle osseuse

Les infections sévères, notamment sepsis, sont un problème majeur de santé publique qui touche près de 50 millions de personnes chaque année dans le monde. Le sepsis est défini comme une infection grave caractérisée par une forte diminution de la pression artérielle et une dysfonction multiple d’organes pouvant conduire au décès du patient. Lors d’un sepsis, le système immunitaire est complètement déréglé, et conduit les patients à un état d’immunodépression, c’est-à-dire à une incapacité du corps à combattre une infection. Notre projet s’intéresse à une enzyme qui joue initialement un rôle de régulation de la pression artérielle et potentiellement un rôle immunitaire. Il a été démontré précédemment qu’une augmentation de notre enzyme d’intérêt dans le sang de patients atteint de sepsis coïncidait avec une plus forte mortalité. Il s’agit donc d’un biomarqueur de mauvais pronostique. Des études précédentes ont montré que notre enzyme d’intérêt est également un facteur induisant des modifications délétères du système cardiaque et potentiellement un modulateur immunitaire. Notre étude a 3 objectifs : 1- Déterminer si la suppression du gène codant pour l’enzyme induit une modification de l’immunité et plus précisément si ceci induit un changement des différentes populations de cellules immunitaires dans la moelle osseuse et le sang, 2- Déterminer les taux de l’enzyme dans les différentes cellules provenant de la moelle osseuse dans des conditions physiologique et pathologique, 3- Vérifier si les cellules issues de la moelle osseuse sont une source de libération de l’enzyme dans la circulation lors de situations de dysfonction d’organe.

Ce projet nous permettra de comprendre le lien qui existe entre les cellules dérivées de la moelle osseuse et l’enzyme. Ce projet apportera des connaissances dans le domaine et surtout pourra bénéficier aux patients qui souffrent de dysfonctions cardiaques aigues qui auront un traitement plus adapté si une association claire entre l’enzyme et activation immunitaire est connue.

Les animaux seront soumis à plusieurs interventions : Pour l’objectif 1, les animaux vont subir une seule fois une anesthésie générale (30s) puis un prélèvement sanguin (5min après l’endormissement) sera réalisé sur ces souris. Pour l’objectif 2, les souris vigiles recevront une injection d’un médicament ou d’une solution saline, 2x par jours, pendant 2 jours, (1min). Une injection sous anesthésie générale d’un anticorps (30s) puis un prélèvement sanguin (30s) sera réalisé. Pour l’objectif 3, les souris « receveuses » seront irradiées (1x pendant 800s). Les souris « donneuses » seront prélevées au niveau des tibias et fémurs après leur mise à mort. L’injection de la moelle osseuse aux souris « receveuses » se fera sous anesthésie générale. Post-greffe, un prélèvement sanguin sous anesthésie générale supplémenté par un collyre analgésiant (5min x3) et des échocardiographies (10min x2) pour suivre leur fonction cardiaque. A deux mois, même intervention que pour l’objectif 2.

Pour l’objectif 1, les souris vont subir une anesthésie générale via une injection intra-péritonéale, ce qui pourra induire un stress sur les animaux. Pour l’objectif 2, les animaux subiront des injections sous cutanée en vigile sur une durée de deux jours, pouvant induire un stress chez l’animal. De plus, l’injection du médicament mimera une insuffisance cardiaque aigue ce qui pourrait générer une douleur ou une gêne chez l’animal. Pour l’objectif 3, les animaux seront sujets à différentes injections : intra-péritonéales pour les anesthésies, sous-cutanée pour l’injection d’’un médicament et intra-orbitaire pour la greffe de cellules de moelle osseuse. Ces injections pourront induire un stress et une gêne chez l’animal. Des prélèvements sanguins en rétro-orbitaire seront réalisés sous anesthésie et en appliquant préalablement un collyre analgésiant. Les prélèvements en rétro-orbitaire pourrait générer un stress et une douleur chez l’animal. Enfin, le protocole ISO mimera une insuffisance cardiaque aigue, ce qui pourrait possiblement générer une douleur ou une gêne chez l’animal.

mise à mort des animaux suite au prélèvement rétro-orbitaire pour permettre la récupération des organes (coeur, poumon, foie, rate, rein gauche et rein droit) ainsi que de la moelle osseuse.

Notre objectif est de déterminer le lien entre notre enzyme d’intérêt et les cellules immunitaires dans un contexte de dysfonction cardiaque aigue comme celle qui survient chez les patients souffrant de choc. Les modèles in vitro et organoïdes ne peuvent mimer les phénomènes pathophysiologiques systémiques, c’est-à-dire les mécanismes modifiant les fonctions organiques mis en jeu dans la maladie.

Les groupes expérimentaux ont été conçus de façon à Réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés. Ce nombre par groupe a été déterminé par calcul statistique pour mettre en évidence une différence significative entre les groupes afin de Réduire au maximum le nombre de souris utilisé. Nous optimiserons nos expérimentations en réalisant le plus grand nombre possible d’analyses et de prélèvements d’organes sur un même animal. Notre critère de jugement principal est la diminution de la taille du ventricule gauche pendant la contraction du cœur appelé la fraction de raccourcissement du ventricule gauche (paramètre indiquant une dysfonction de la contraction cardiaque).

Les animaux sont hébergés dans des conditions standard d’environnement (22°C, 50% hygrométrie). Les cages sont enrichies de maisons, bâtons à ronger, coton de nidification pour leur permettre d’exprimer tout leur comportement social. Des points limites adaptés et une surveillance quotidienne des animaux permettent de prévenir toute forme de souffrance des animaux. Les protocoles expérimentaux se feront sous anesthésie générale afin d’éviter le plus possible une quelconque douleur chez l’animal. Un collyre analgésique sera utilisé avant chaque injection et chaque prélèvement rétro-orbitaire. Un antibiotique est également utilisé afin de minimiser les risques d’infection post-irradiation. Les animaux seront surveillés quotidiennement par les expérimentateurs et/ou le personnel de l’animalerie. L’optimisation du protocole inclura une seule anesthésie pour l’évaluation de la fonction cardiaque par échocardiographie et le prélèvement sanguin. Des points critiques et scorés permettant d’objectiver la douleur ou la gêne de l’animal ainsi que les dispositions à suivre en fonction du score obtenu ont été préalablement définis.

Le modèle murin présente de nombreux avantages pour notre projet de recherche. Outre sa petite taille et son hébergement aisé le modèle de dysfonction cardiaque aigue comporte de nombreuses similitudes avec la dysfonction cardiaque chez l’Homme. Des souris mâles de 12 à 20 semaines seront utilisés pour l’objectif 1 et 2 du projet. Et des souris mâles et femelle de 8 à 12 semaines seront utilisés pour l’objectif 3 du projet. L’utilisation des souris jeunes adultes permet d’obtenir des résultats plus fiables et pertinents grâce à leur maturité physiologique, leur homogénéité et leur robustesse.