Décryptage des mécanismes moléculaires déclenchés par la sur-expression d’un facteur de croissance dans un modèle murin de dystrophie musculaire de Duchenne

La dystrophie musculaire de Duchenne (DMD) est une maladie génétique à transmission récessive liée au chromosome X due à l’absence de la protéine dystrophine. Cette maladie entraîne une dégénérescence de l’ensemble des muscles (squelettique, cardiaque ou lisse), une inflammation, de la fibrose et une perte de masse et de force musculaire. Il n’existe pas à ce jour de traitement pour la DMD mais des stratégies de thérapie génique prometteuses sont en cours d’évaluation dans des essais cliniques. Parmi les approches de thérapie génique, la restauration de la protéine dystrophine est la plus prometteuse. Néanmoins, nous savons aujourd’hui que la restauration de dystrophine devra s’accompagner d’une stratégie permettant un meilleur maintien de l’intégrité musculaire. En effet, chez les patients DMD, les fibres dépourvues de dystrophine se cassent et dégénèrent. La force musculaire diminue et le tissu musculaire laisse la place aux tissus conjonctif et graisseux. Les stratégies thérapeutiques sont confrontées à des limites comme la dégénérescence des fibres musculaires dystrophiques et la perte du bénéfice thérapeutique. Dans cette optique, nous envisageons de poursuivre nos investigations sur les mécanismes moléculaires mis en jeu suite à l’injection d’un facteur de croissance qui possède un réel potentiel thérapeutique en améliorant l’intégrité du muscle dystrophique.

Nous attendons, comme bénéfices à court terme, une amélioration du phénotype dystrophique lorsque les souris sont traitées avec le facteur de croissance d’intérêt. A long terme, cette molécule pourrait être utilisable chez le patient atteint de dystrophie musculaire de Duchenne en complément des outils de thérapie génique en cours de développement.

Les animaux seront soumis à plusieurs types d’interventions telles que : 1/ Quatre injections intramusculaires (10 minutes) effectuées sous anesthésie et analgésie à un stade précoce suivies d’une euthanasie par une méthode réglementaire afin de réaliser les différents prélèvements nécessaires aux analyses. 2/ Quatre injections intramusculaires (10 minutes) effectuées sous anesthésie et analgésie à un stade précoce (10 minutes) associés à deux injections intrapéritonéales sur animal vigile espacées de 24h (1 minute/injection) suivi d’une euthanasie par une méthode réglementaire afin de réaliser les différents prélèvements nécessaires aux analyses. 3/ Quatre injections intramusculaires (10 minutes) effectuées sous anesthésie et analgésie à un stade précoce suivies d’une mesure ayant pour but de mesurer l’activité électrique des nerfs et des muscles effectuée sous anesthésie et analgésique (30 minutes) et enfin une mesure de la contractilité musculaire sous anesthésie et analgésie (25 minutes) après laquelle les animaux seront euthanasiés par une méthode réglementaire afin de réaliser les différents prélèvements nécessaires aux analyses.

La souris mdx présente un phénotype dommageable pouvant s’expliquer par un phénotype anxieux, l’apparition d’une crise inflammatoire d’une durée de 3 semaines à 3 semaines de vie et d’une faiblesse musculaire à 2 mois de vie. Certains animaux peuvent avoir un pelage terne et le dos vouté à partir de 3 mois de vie et des problèmes d’audition à partir de 5 mois de vie. Lors du transport entre l’animalerie fournisseur et notre animalerie et à l’arrivée dans leur nouvel environnement, les animaux pourront subir un stress dû aux mouvements des cages de transport, lors de leur transfert dans leur nouvelle cage, pendant les premiers jours après leur arrivée et si l’alimentation n’est pas identique. Au moment des injections intramusculaires et des procédures d’analyse fonctionnelle, les animaux subissent un stress lorsqu’ils sont placés dans la cage à induction pour l’anesthésie gazeuse et une douleur/inconfort équivalent à l’introduction d’une aiguille lors des injections en intrapéritonéal. Suite à l’injection intramusculaire, une gêne et/ou une anomalie au niveau du site d’injection pourrait éventuellement apparaître. De même, lors de la procédure permettant la mesure de l’influx nerveux, des électrodes sont placées en sous-cutané dans le tibialis anterieur, ce qui peut induire une gêne au réveil de l’animal. Au cours de l’anesthésie profonde, les animaux pourraient être victimes d’hypothermie ou d’arrêt cardio-respiratoire suite à l’administration de l’anesthésie.

Tous les animaux seront euthanasiés à la fin des procédures pour récupérer les prélèvements nécessaires aux analyses prévues. Les géniteurs seront euthanasiés après 8 mois de vie ou après la génération de 4 portées pour les femelles.

Le but de notre projet est l’identification d’une possible stratégie thérapeutique pour le maintien de l’intégrité musculaire dans le muscle dystrophique. L’utilisation d’un modèle murin de la dystrophie musculaire de Duchenne est indispensable car les modèles in vitro ne peuvent rendent compte de la dégénerescence progressive observée au cours de cette maladie. Ce modèle est celui qui est signalé dans les directives pour l’étude de la dystrophie musculaire de Duchenne. Il s’agit du modèle le plus approprié car il est bien caractérisé, avec un phénotype connu et avec beaucoup de littérature à l’appui. La finalité de cette étude est de développer des stratégies thérapeutiques, ce qui ne peut se faire que sur un modèle animal. Néanmoins, autant que possible et si la question posée peut être résolue ainsi, des expériences in vitro avec des lignées cellulaires seront réalisées pour limiter au maximum le recours à l’utilisation de souris.

Les processus expérimentaux seront conçus de façon à utiliser un nombre de souris limité. Pour tous les groupes expérimentaux et toutes les méthodes d’analyse, 5 à 8 animaux est un nombre d’échantillons minimum pour obtenir des résultats statistiquement analysables. Néanmoins, considérant une forte hétérogénéité chez les souris dystrophiques, des groupes de 6 à 12 souris par condition seront nécessaires pour permettre une analyse statistique fiable, pour éviter que la variabilité des paramètres de mesures in vivo puisse empêcher la bonne exploitation des résultats. Les protocoles seront rigoureusement élaborés et réfléchis en avance pour que l’expérience soit interprétable et pour éviter de les répéter. Au total, nous prévoyons d’utiliser 812 animaux (584 souris dystrophiques et 228 souris contrôles). La taille des effectifs sera établie grâce à un calcul de puissance et nous procéderons à des tests statistiques pour une interprétation fiable des résultats.

Nous respecterons une période d’acclimatation de 2 semaines pour les animaux sauvages provenant d’un éleveur extérieur. Les conditions d’hébergement et l’enrichissement du milieu sont gérés par l’animalerie. Elles consistent en un contrôle quotidien des cages, un changement régulier, un nombre réduit d’animaux par cage (5 maximum) et pas d’animaux isolés. Le changement des cages se fait sous hotte aspirante et les cages possèdent des filtres. L’enrichissement du milieu consiste en l’ajout de laine de bois afin que les souris puissent faire un nid ainsi que de lanières de papier Kraft et de tunnels de carton dans les cages d’accouplement. Enfin, si nécessaire, la nourriture pourra être mise à disposition sur le plancher de la cage. Pour limiter la souffrance et l’angoisse, les procédures qui le nécessiteront seront réalisées sous anesthésie et sous analgésiques. Au cours des différentes procédures, la température des souris est maintenue constante à l’aide d’une plate-forme chauffante thermorégulée à 37 degrés. Les animaux seront ensuite suivis quotidiennement afin de relever le moindre signe de souffrance. Nous mettrons en place des points limites adaptés, suffisamment prédictifs et précoces pour permettre de limiter la douleur à son minimum. Nous procèderons à l’euthanasie compassionnelle de l’animal avant qu’il ne souffre. Le suivi des animaux sera conduit par un personnel autorisé et compétent pour reconnaître, quantifier et atténuer ou supprimer les signes de douleur ressentie chez les animaux.

Le but de notre projet est la caractérisation de nouvelles voies moléculaires et l’identification de cibles thérapeutiques potentielles pour le maintien de la masse musculaire du muscle dystrophique. La souris présente l’avantage de permettre des études moléculaires et fonctionnelles du muscle squelettique. Le modèle de souris dystrophique utilisé est celui qui est signalé dans les directives pour l’étude de la dystrophie musculaire de Duchenne. Ce modèle est le plus approprié car il est bien caractérisé, avec un phénotype connu et avec beaucoup de littérature à l’appui. Nous utiliserons des souris âgées de 7 jours car nous souhaitons étudier l’impact de la sur-expression de notre facteur de croissance d’intérêt sur le processus de nécrose régénération qui a lieu à 4 semaines de vie. Et nous utiliserons des géniteurs âgés de 2 à 8 mois.