Impact de la glycation des globules rouges lors de processus hémorragiques cérébraux chez le poisson zèbre

Les accidents vasculaires cérébraux (AVC) de type hémorragique représentent environ 20 % des AVC (Inserm). Bien que minoritaires, les conséquences de ces AVC sont plus graves (séquelles neurologiques, donc handicaps, et mortalité plus sévères. A l’origine de cette gravité, le déversement des globules rouges dans le parenchyme cérébral entraine la formation d’un hématome puis d’un œdème cérébral comprimant le tissu nerveux et favorisant le développement d’un stress oxydant et inflammatoire. Ces processus entrainent l’activation des cellules immunitaires du cerveau (les microglies) qui migrent et phagocytent les globules rouges pour limiter la perte d’homéostasie du tissu nerveux. Cependant, la clairance des globules rouges reste limitée, ce qui aggrave les séquelles neurologiques de l’AVC hémorragique. Un certain nombre de données de la littérature semble indiquer que le diabète pourrait avoir un impact négatif sur le pronostic des AVC hémorragiques. En situation diabétique, les globules rouges sont glyqués (groupements sucrés présents), pro-oxydant, et plus fragiles. Nous émettons donc l’hypothèse que lors d’un AVC hémorragique, la présence de globules rouges glyqués (« diabétiques ») dans le parenchyme cérébral pourrait aggraver la lésion cérébrale et impacter le processus de clairance des globules rouges par les microglies. Afin de tester cette hypothèse, nous souhaitons injecter des globules rouges (dits GR) et des globules rouges glyqués (GR « diabétiques ») dans le parenchyme cérébral du poisson zèbre, un animal modèle de plasticité cérébrale qui supporte très bien les chocs hémorragiques. En effet, ce dernier peut subir des lésions cérébrales entrainant des hémorragies cérébrales importantes avec un excellent taux de survie (supérieure à 90%) et sans séquelles neurologiques visibles. Ainsi, nous souhaitons étudier les processus de réactivité microgliale et de phagocytose permettant la clairance des globules rouges à un temps de cinétique clé : 2 jours post lésion/injection. Effectivement, après un traumatisme hémorragique chez le poisson zèbre, les microglies sont très largement activées à 2 jours et commencent à revenir à un état initial vers 5 jours.

Ce projet cherche à déterminer si la glycation des globules rouges entraine une modification de la réactivité des microglies plus importantes et des processus de phagocytose associés. Aussi, ce projet pourra apporter des éléments de compréhension quant à la sévérité des AVC hémorragiques en situation diabétique (globule rouge glyqué) qui semble plus importante. A très long terme, ce projet pourrait permettre de moduler l’activité des microglies afin de favoriser la clairance des globules rouges dans le parenchyme cérébral à la suite d’un AVC hémorragique chez le patient diabétique et non diabétique afin d’améliorer la récupération du patient et de limiter la mortalité.

L’ensemble des animaux sera anesthésié et placé sous une binoculaire pour réaliser une lésion de l’hémisphère droit du télencéphale (partie du cerveau). Les animaux seront ensuite immédiatement microinjectés avec la solution contrôle, des globules rouges, des globules rouges glyqués. L’ensemble de cette procédure (aneshtésie + microinjection) dure moins de 5 minutes. Les animaux seront analysés 48h après injection (après mise à mort).

Les nuisances subies par l’animal sont l’anesthésie, la microlésion/microinjection du télencéphale, la microhémorragie mimée par l’injection des globules rouges sous anesthésie. La procédure (lésion + injection) dure moins d’une minute. Le temps total d’anesthésie total avant la phase de réveil est de moins de 5 minutes. Les nuisances possibles sont un stress, une locomotion altérée, une difficulté d’alimentation et éventuellement la mort de l’animal.

Tous les animaux seront mis à mort 48 heures après la microinjection par anesthésie suivie de surdosage anesthésique (Tricaïne). Le cerveau sera récupéré ensuite pour analyse.

La complexité des processus physiologiques se déroulant lors d’une hémorragie cérébrale ne sont pas modélisables par des techniques in vitro. Ils impliquent un œdème, la migration et la prolifération des microglies, ainsi que leur activité de phagocytose. De plus, plusieurs processus physiologiques se mettent en place lors d’un dommage cérébral comme un AVC hémorragique (hypoxie, inflammation, stress oxydatif, sécrétion de facteurs trophiques et neurotrophiques ainsi qu’endothéliaux). A l’heure actuelle, nous ne pouvons réaliser des procédures in vitro permettant d’intégrer l’ensemble de ces acteurs cellulaires et de signalisation. C’est pourquoi le modèle in vivo est pertinent.

Chaque expérimentation sera scindée en 3 expériences indépendantes (3 x 10 animaux par groupe). Cela permettra de ne pas utiliser l’ensemble des animaux si nous observons que les résultats obtenus sont suffisamment étayés. De plus, si jamais une souffrance ou une mortalité inattendue venait à apparaitre, cela éviterait de relancer une expérimentation. D’après notre expérience et connaissance du modèle via des expérimentations similaires, le nombre de 3 X 10 animaux par groupe permet de pallier à l’hétérogénéité de réponses des animaux, et des tests statistiques seront réalisés.

Les animaux seront observés plusieurs fois par jour dans leur aquarium. Après lésion, ils seront observés de façon intensive dans les premières 30 minutes suivant la lésion/injection, puis une fois toutes les heures. Tout signe de souffrance ou de comportement anormal sera rapporté au vétérinaire référent afin de prendre les mesures adéquates. Un espace suffisant limitant au maximum les contraintes subies et permettant un comportement normal sera assuré. Les procédures invasives seront réalisées sous anesthésie générale par une personne qualifiée. Différents points limites spécifiques tels qu’un comportement anormal (mouvements circulaires), nutrition anormale (voire incapacité à se nourrir), flottabilité anormale, couleur anormale seront analysés (Les animaux seront observés plusieurs fois par jour dans leur aquarium. Si un de ces paramètres ou points limites est atteint, nous en ferons part au vétérinaire pour arrêt de l’expérimentation et par conséquent euthanasie pour limiter les souffrances de l’animal (sédation profonde puis mise à mort). A noter, que les données bibliographiques et notre expérience du modèle ne rapporte pas de comportements de souffrance anormale, de modification de la prise alimentaire, du comportement locomoteur notable à la suite d’une lésion

Le poisson zèbre partage de 70 à 85 % de gènes en commun avec l’espèce humaine, impliqués dans les processus physiologiques et pathophysiologiques, respectivement. De plus, c’est également un modèle reconnu de réparation cérébrale avec des processus de réparation similaires à ceux des mammifères. Animaux mâles pour éviter l’effet hormonal du cycle ovarien chez la femelle. Animaux adultes agés entre 3 mois et 18 mois. A ces stades, les processus régénératifs sont globalement similaires.