Rôle d’Atg7 dans le renouvellement des noyaux musculaires

Dans nos cellules, les organites ne sont pas permanents et subissent des dommages constants. Ces dommages déclenchent un mécanisme de nettoyage appelé autophagie, qui permet à la cellule d’éliminer les éléments endommagés. Contrairement aux autres organites, la plupart des cellules n’ont qu’un seul noyau, qui n’est donc pas considéré comme jetable. Cependant, les cellules musculaires squelettiques ont la particularité d’avoir des centaines de noyaux, ce qui pourrait faire du noyau un organite jetable. Nos recherches antérieures ont en effet montré que les cellules musculaires éliminent constamment les noyaux préexistants. Cependant, le mécanisme à l’origine de ce processus reste inconnu. Dans ce projet, nous explorons la possibilité que l’autophagie soit impliquée en suivant les noyaux marqués dans les fibres musculaires grâce à des outils génétiques développé chez la souris.

Les résultats de ce projet apporteront un éclairage totalement nouveau sur la façon dont nous concevons l’homéostasie du tissu musculaire. Elles auront à leur tour un impact important sur la compréhension des maladies musculaires et du vieillissement, où de nombreux noyaux musculaires aberrants s’accumulent.

Administration de doxycycline par voie orale dans l’eau de boisson pendant 1 mois pour induire la délétion de notre gène d’intérêt dans les myofibres.

La doxycycline est un antibiotique largement utilisé et son administration n’entraîne aucune gêne. La conséquence de son administration est le marquage des noyaux musculaires qui n’induit pas, non plus, de gêne. La perte de notre gène d’intérêt dans les myofibres a été signalée, dans une autre étude, comme provoquant une gêne modérée : les souris ne meurent pas prématurément et ne développent pas de dystrophie, mais elles présentent un déclin progressif de la fonction musculaire au fil du temps. Cette gêne modérée ne sera présente que chez les animaux délété du gène d’intérêt dans les myofibres après induction par la doxycycline soit 42 animaux. Les 42 animaux contrôles ne sont pas impactés, ils ne subiront aucune gêne.

Pour parvenir à des conclusions scientifiques solides avec le nombre minimal d’animaux utilisés, nous collecterons, post mortem, tous les tissus musculaires pertinents de tous les animaux à la fin de la procédure. Par conséquent, nous ne réutiliserons pas, ne remplaçons pas et ne ferons pas adopter les animaux.

Notre projet porte sur la dynamique cellulaire et nécessite donc la présence de plusieurs structures cellulaires complexes. Il est important de noter qu’il n’existe actuellement aucun modèle de culture cellulaire permettant d’éliminer les noyaux musculaires préexistants (nous n’avons obtenu que récemment des données montrant que cela peut se produire chez les animaux dans notre propre équipe). Nous ne connaissons aucune méthode pour induire l’élimination des noyaux des cellules musculaires cultivées, ce que nous devrons comprendre en utilisant des modèles de souris. Enfin, nous souhaitons souligner les limites des cellules musculaires différenciées in vitro. Ces cellules sont extrêmement immatures et incomplètes car elles manquent de nombreuses caractéristiques des cellules musculaires matures : par exemple, absence de jonction muscle-neurone, absence de jonction muscle-tendon, absence de sarcomères matures, noyaux ne se déplaçant pas vers la périphérie de la cellule et se regroupant plutôt au centre de la cellule, etc. Si un chercheur étudie des mécanismes impliquant des événements de différenciation très précoces (par exemple, la sortie du cycle cellulaire, l’expression de gènes de différenciation précoce, la fusion musculaire, etc. ), les modèles in vitro existants peuvent s’avérer utiles. Cependant, pour toute question scientifique concernant des cellules musculaires entièrement matures et leurs structures (comme les nôtres), ces modèles de culture ne peuvent malheureusement pas Remplacer les modèles animaux. Les modifications génétiques que nous utilisons ne sont possibles que chez la souris. Elles nous permettent d’étudier la fonction des gènes dans des conditions biologiques appropriées.

Notre étude du renouvellement des noyaux musculaires dans le temps reprend des points temporaux déjà établis dans des études précédentes. De plus nous collecterons tous les tissus musculaires pertinents de chaque souris, ce qui réduira considérablement le nombre de souris utilisées. La puissance statistique a été utilisée pour calculer le nombre de souris nécessaire afin de déterminer si une différence statistiquement significative existe entre 2 groupes. Il a été déterminé que le nombre optimal de souris par groupe pour ce projet est de 7 femelles et 7 males afin d’obtenir une différence statistiquement significative.

Au cours de notre projet nous attendons un déclin progressif de la fonction musculaire au fil du temps chez les animaux délété pour notre gène d’intérêt dans les myofibres. Ce déclin sera très modéré néanmoins tout signe de douleur sera pris en charge par des mesures appropriées en fonction du niveau de douleur observé (0 à 3). Si une douleur est présente, elle sera traitée soit par l’administration d’un analgésique, soit par l’euthanasie prématurée des animaux concernés. Niveau 0 : aucune douleur, aucun inconfort détecté. Niveau 1 : douleur légère (exemple : inconfort léger au niveau d’un membre type légère boiterie), dans ce cas les souris seront contrôlées quotidiennement. Niveau 2 : la douleur est présente (exemple : douleur manifeste d’un membre entrainant un problème de déplacement), dans ce cas un analgésique sera administré à la souris. Niveau 3 : douleur intense (exemple : paralysie des membres), dans ce cas un analgésique plus puissant sera administré et les animaux seront euthanasiés prématurément si nécessaire pour éviter une douleur chronique. Les souris seront surveillées régulièrement. Le suivi de nos souris comprend une observation visuelle du comportement général (perte de poids, apathie, yeux fermés). Si des souris devaient présenter des difficultés à se déplacer et donc des difficultés à manger de la nourriture solide (croquettes), de la nourriture en gel sera placée dans la litière de la cage.

Nous utilisons des outils génétiques pour le suivi des noyaux musculaires, qui sont établis dans des modèles de souris. La lignée de souris permettant la délétion de notre gène d’intérêt, et donc de la protéine, après croisement avec une lignée exprimant la protéine Cre recombinase est également établie. La souris est donc le meilleur choix pour mener cette étude. Comme notre projet se concentre sur la régulation de la dynamique cellulaire dans les muscles matures, nous devons utiliser des souris dont le développement est terminé. Nous utiliserons donc des animaux adultes, mâles et femelles, âgés d’au moins 10 semaines.