Propriétés physiopathologiques des réseaux neuronaux de la Dysplasie Focale Corticale

La Dysplasie Focale Corticale (FCD) est une malformation du développement cortical, à l’origine d’épilepsies résistantes aux médicaments chez l’enfant et l’adulte. Ce projet vise à élucider les mécanismes et les effets pathologiques de la FCD sur l’apparition des crises épileptiques, de même que ses répercussions sur le fonctionnement cérébral ainsi que sur les altérations cognitives et comportementales. Pour atteindre cet objectif, des enregistrements cérébraux seront effectués par imagerie, et électroencéphalographie (EEG) accompagnés d’analyses du comportement (mesures des performances cognitives, de l’humeur et sensorimotrices) à partir d’un modèle murin de FCD (souris).

Ce projet de recherche est essentiel, car il vise à élucider les mécanismes développementaux menant à la formation d’une région cérébrale pathologique dans le contexte de la Dysplasie Focale Corticale (FCD), et leurs conséquences sur le fonctionnement cérébral, les crises d’épilepsie, ainsi que sur les altérations cognitives et comportementales (mesures des performances cognitives, de l’humeur et sensorimotrices) à partir d’un modèle murin de FCD (souris). Il est important de noter que cette malformation développementale est souvent associée à des formes d’épilepsie résistantes aux traitements pharmacologiques classiques, ce qui souligne l’urgence de découvrir des alternatives thérapeutiques innovantes. En décryptant les processus sous-jacents à la FCD à partir d’un modèle murin (souris), ce projet aspire ainsi à révéler de nouvelles voies thérapeutiques pour traiter les patients pharmacorésistants souffrant de FCD.

Notre projet de recherche vise à étudier la Dysplasie Corticale Focale (FCD), une pathologie humaine bien décrite, modélisée chez la souris, afin d’examiner les anomalies cérébrales, les crises épileptiques résultantes, et de tester un traitement potentiel basé sur la thérapie génique. Pour modéliser la FCD, nous traiterons des souris au stade embryonnaire, chez des femelles gestantes (non épileptiques) pour induire la FCD (30-45 minutes par femelle, sous analgésie et anesthésie) chez ces embryons. Ainsi, les souris FCD présentent des crises épileptiques comme les patients souffrant de la même pathologie. Pour l’analyse par imagerie, certaines de ces souris recevront à la naissance une injection cérébrale d’une sonde fluorescente (moins de 5 minutes, sous anesthésie). Plusieurs jours après (5 au minimum), un petit dispositif d’observation sera installé (en 30 minutes, sous analgésie et anesthésie) pour imager le cerveau des souriceaux et des adultes ; les enregistrements seront réalisés par période de 10-30 minutes par jour, pendant 5 jours maximum sur des animaux vigiles. Pour analyser les crises d’épilepsie, un autre groupe de souris recevra un dispositif permettant l’enregistrement de l’électroencéphalogramme (EEG) (en moins de 30 minutes, sous analgésie et anesthésie). Après une semaine de récupération, les enregistrements EEG seront réalisés sur une période de 7 à 15 jours sur des animaux vigiles. Pour tester la thérapie génique, une injection sera effectuée dans le cerveau (15 minutes, sous analgésie et anesthésie), au moins 3 semaines avant l’EEG ou l’imagerie. À la fin des expériences, les cerveaux de toutes les souris seront prélevés sous anesthésie profonde. Il faut souligner qu’à chaque étape, une attention particulière est portée au respect des normes éthiques et au bien-être animal. Des mesures de suivi, d’analgésie, et de soins post-opératoires sont systématiquement appliquées pour minimiser la douleur et le stress des animaux.

Un des effets indésirables potentiels pourra être lié aux crises d’épilepsie chez les souris ayant développée une Dysplasie Corticale Focale (FCD) (environ 1-5/jour), induite par un traitement local au niveau du cerveau lors de leur développement à l’état embryonnaire. Certaines souris subiront également des chirurgies spécifiques et nécessaires à nos techniques d’imagerie cérébrale et de suivi de l’activité électrique du cerveau par électroencéphalographie. Enfin, certaines souris seront soumises à des tests comportementaux basés sur des comportements naturels et spontanés bien établis et reconnus.

A la fin des procédures expérimentales, l’étendue de la Dysplasie Focale Corticale (FCD) doit être vérifiée et quantifiée par une analyse histologique du cerveau des souris FCD. Pour réaliser cette analyse histologique, les animaux sont euthanasiés selon les procédures réglementaires et les principes des 3Rs.

L’objectif du projet est de décrire et d’étudier l’activité de la malformation du cerveau résultant de la Dyspalsie Focale Corticale (FCD) à partir d’un modèle murin (souris) et de tester l’efficacité de la thérapie génique sur les mécanismes pathologiques et handicapants de la FCD (fonctionnement cérébral altéré, crises d’épilepsie, altérations du comportement) par une analyse multidimensionnelle (imagerie cérébrale, EEG, analyse comportementale), afin de pouvoir proposer de nouvelles alternatives thérapeutiques pour améliorer la qualité de vie des patients. Du fait de cette analyse multidimensionnelle, il n’est donc pas possible de substituer les souris FCD par des modèles alternatifs (c-a-d des modèles qui serait générés in vitro, comme des cultures neuronales par exemple). En effet, les rongeurs reproduisent fidèlement les caractéristiques cardinales de la FCD décrites chez les patients souffrant de cette pathologie, et ils constituent par conséquent un modèle de choix pour l’analyse du fonctionnement cérébral, des crises d’épilepsie, et du comportementale (mesures des performances cognitives, de l’humeur et sensorimotrices).

Dans le cadre de notre engagement envers les principes des 3Rs, le calcul du nombre d’animaux nécessaires au projet a été déterminé par une approche statistique. De plus, les expériences seront réalisées avec un souci permanent de Réduction du nombre d’animaux. La méthode utilisée d’imagerie cérébrale in vivo permet l’enregistrement d’un très grand nombre de neurones (plusieurs centaines) par souris, et donc de diminuer le nombre d’animaux utilisés. Une même portée sera utilisée par plusieurs expérimentateurs, les nouveau-nés non utilisés pour les études développementales seront utilisés dans le cadre d’études menées chez l’adulte, et mâles et femelles seront utilisés. De plus, des souris seront incluses dans des études longitudinales et le coté contra-latéral, non-FCD, servira de contrôle. Pour finir, une part de l’étude sera également menée sur des tranches de cerveau de souris FCD permettant ainsi de Réduire le nombre d’animaux utilisée in vivo pour l’expérimentation. L’ensemble de ces points permettra de diminuer de façon importante le nombre d’animaux utilisés.

Les expériences seront réalisées avec un souci permanent de Raffinement des procédures expérimentales. Le Raffinement inclue tout d’abord la mise en place par la formation du personnel sur les techniques de manipulation douce et minimisation de la douleur et de la souffrance, une surveillance et un ajustement continu des soins pour une prise en charge personnalisée. Ainsi, le bien-être des animaux, la croissance staturo-pondérale, l’aspect général et le comportement seront suivis de façon spécifique, qu’il s’agisse de souris adultes, gestantes et de leur progéniture. Lors de la chirurgie, la douleur et le stress, sera prise en charge par l’utilisation d’analgésiques, d’antiinflammatoires, d’anesthésie locale et générale, et le maintien des animaux sur un tapis chauffant pour préserver leur température corporelle. En post-chirurgie, la douleur et la souffrance sera aussi prise en charge avec l’utilisation d’analgésiques, d’antiinflammatoires, durant les 3 premiers jours. Le niveau de souffrance et de douleur sera établi à l’aide d’une grille spécifique pour établir un score; si le score atteint une certaine limite préétablie, l’animal en souffrance sera euthanasié. Il faut souligner qu’une attention particulière sera portée aux nouveau-nés en particulier après leur réintroduction au sein de la portée. Les mères et leur nouveau-nés, opérés ou non, seront hébergés avec de la nourriture et de l’eau ad libidum dans des armoires ventilées, et sous environnement contrôlé, dans des cages enrichies d’igloos cartonnés et de mini-rouleaux de papier foisonnant permettant aux souris de faire des nids. Les animaux sevrés et les adultes seront hébergés dans les mêmes conditions à 3-5 animaux par cage après avoir séparé les mâles et les femelles.

Les raisons d’utiliser des modèles murins sont nombreuses. Dans nos expériences, les souris présentent une organisation morpho-fonctionnelle suffisamment complexe et évoluée pour permettre de tirer des conclusions générales sur la mise en place de malformations du cerveau lors du développement et de leurs conséquences à l’âge adulte, en particulier dans un contexte pathologique comme la Dysplasie Focale Corticale (FCD), qui est une pathologie développementale. Ainsi, pour analyser les anomalies qui se mettent en place lors du développement, nous utiliserons des souris à différents âges postnataux incluant les différents stades de développement (0-40 jours postnataux) ainsi que des animaux adultes (2-4 mois).