Etude d’un nouveau modèle murin pour comprendre une maladie humaine liée aux mutations d’un canal ionique

L’objectif de ce projet est d’étudier l’effet d’une mutation d’un canal ionique (c’est-à-dire une protéine impliquée dans l’excitabilité des cellules) retrouvée chez l’Homme et qui engendre, chez les patients atteints, de graves altérations du développement du système nerveux. Ce projet se déroulera dans 2 établissements utilisateurs, nommés ci-après EU1 et EU2.

Les objectifs du projet sont les suivants : (1) Comprendre quels sont les mécanismes moléculaires à l’origine du syndrome CLIFAHDD (Congenital contractures of the LImbs and FAce, hypotonia, and Developmental Delay / Contractures congénitales des membres et du visage, hypotonie et retard de développement) ; (2) Déterminer le rôle du canal calcique responsable de ce syndrome dans le développement du cerveau et du cervelet. (3) Tester et vérifier l’efficacité du modèle murin comme représentation préclinique du syndrome CLIFAHDD, dans le but ultime d’évaluer des possibilités de traitement.

Pour ce projet, nous évaluerons un total de 1728 animaux, qui seront utilisés comme suit: • 672 animaux seront évalués pour détecter, au travers de tests standardisés, des retards dans leur développement, ainsi que dans leurs capacités motrices et cognitives. Ces évaluations se dérouleront sur une période d’environ 6 mois. Pour les souris agées de moins de 21 jours, les tests sont limités à deux min par test et sont réalisés sur une plaque chauffante maintenue à 23°C. Ces tests seront réalisés dans l’EU1 • 576 animaux subiront une chirurgie d’environ 30 min afin de permettre l’enregistrement d’électroencéphalogrammes (EEG). L’EEG sera enregistré pendant environ 1 mois, avec une séance de 6 heures par semaine pour chaque animal. Ces expériences seront réalisées à l’EU1 • 480 animaux participeront à une étude longitudinale où des échographies du cerveau et du cervelet seront réalisées pour examiner les paramètres anatomiques et fonctionnels. Ces échographies seront effectuées lors de courtes séances d’acquisition, d’une durée de 15 minutes, sous anesthésie. Il est important de noter que certains des tests impliquent des procédures potentiellement stressantes pour les animaux, notamment un hébergement individuel temporaire. Néanmoins, toutes les mesures nécessaires seront prises pour assurer leur bien-être tout au long de l’étude. Cette étude longitudinale sera réalisée dans l’EU2.

Pour des animaux porteurs de la mutation, les symptômes présentés par les patients suggèrent qu’ils peuvent présenter des retards dans leur développement et leurs capacités cognitives, ainsi que des problèmes physiques tels que des déformations articulaires, des traits physiques inhabituels, une faiblesse musculaire, des difficultés respiratoires et de sommeil, des perturbations du rythme circadien, des crises d’épilepsie, des troubles de l’équilibre dus à une détérioration du cervelet et une constipation sévère et une importante léthargie peut également affecter leur capacité à se nourrir. Les études comportementales ainsi que les examens d’échographie sont non invasifs et indolores en eux-mêmes. Cependant, pour minimiser tout stress causé par la manipulation par les expérimentateurs, les séances d’évaluation seront précédées d’une période d’habituation à la manipulation d’au moins 5 jours. Le suivi des crises d’épilepsie à travers l’enregistrement électroencéphalographique (EEG) nécessitera une intervention chirurgicale (anesthésie, acte chirurgical, gestion de la douleur post-opératoire, risque d’infections). Toutes les précautions seront prises pour éviter toute douleur liée à la chirurgie. Après l’opération, les animaux seront hébergés individuellement pendant le temps nécessaire à la guérison ; ce temps n’excédera pas 7 jours.

L’ensemble des animaux contribuant aux 3 procédures de ce projet seront euthanasiées. Les organes, tout particulièrement le cerveau, seront prélevés en post-mortem pour des analyses histologiques.

Le développement, déjà précédé d’une étape de validation in vitro, et la caractérisation d’un modèle murin sont essentiels pour étudier le syndrome CLIFAHDD. Ce modèle animal sera utilisé exclusivement pour des expériences in vivo et ex vivo (prélèvements d’organes) qui ne peuvent être effectuées sur des modèles in vitro ou via des simulations informatiques de la maladie. Pour l’instant, les conséquences fonctionnelles de la mutation du canal calcique responsable du syndrome CLIFAHDD sont examinées à travers des expériences d’électrophysiologie sur des lignées cellulaires, et des simulations informatiques seront développées pour modéliser ces conséquences sur l’excitabilité neuronale. Ces approches in vitro et in silico permettent de comprendre l’impact de la mutation au niveau cellulaire, mais elles ne peuvent pas rendre compte des effets sur l’ensemble de l’organe, en l’occurrence le cerveau, car les réseaux neuronaux établis pendant le développement cérébral ne peuvent pas être reproduits en culture ou par simulation informatique. Pour ce qui est de l’étude des caractéristiques phénotypiques telles que les problèmes de locomotion, les troubles du sommeil et les désynchronisations des rythmes circadiens, elles ne peuvent être étudiées que sur des animaux vivants.

Le nombre d’animaux utilisés pour ce projet, estimé à 1728, a été soigneusement déterminé pour nous permettre d’atteindre nos objectifs scientifiques de manière statistiquement significative. Nous avons élaboré une stratégie de croisement optimale pour maximiser l’efficacité de nos expériences. En utilisant des individus des deux sexes, nous cherchons à Réduire le nombre total d’animaux nécessaires à produire. Dans la mesure du possible, nous réaliserons les expériences comportementales (in vivo) et les analyses anatomiques, tissulaires et cellulaires sur les mêmes animaux. Pour déterminer statistiquement la taille des groupes d’animaux à tester, nous nous sommes basés sur des recherches publiées ainsi que sur l’utilisation d’un logiciel spécialisé pour évaluer statistiquement le nombre d’animaux requis. Les tailles de chaque groupe d’animaux à générer pour ce projet ont été calculées en utilisant des tests paramétriques capables de détecter des différences significatives. Cela garantit que nos résultats seront robustes et fiables, tout en minimisant le nombre d’animaux nécessaires pour mener à bien nos études.

Le suivi de l’état de santé des animaux sera rigoureusement respecté et effectué de manière régulière. Des critères spécifiques ont été définis pour détecter les signes de détresse (comme une perte de poids continue et excessive, une prostration, des poils ébouriffés, un arrêt de l’alimentation, etc.), et des mesures de Raffinement seront mises en place pour assurer une prise en charge adaptée des animaux. Cela peut inclure l’utilisation d’analgésiques et, dans les cas les plus graves, la décision d’euthanasie. Pour minimiser le stress des animaux causé par la manipulation par les expérimentateurs, les sessions d’évaluation seront précédées d’une période d’habituation d’au moins 5 jours. En ce qui concerne les douleurs liées à la chirurgie (pour les mesures d’EEG par exemple seront réalisées sous anesthésie générales pour éviter toute souffrance associée à l’intervention. Après la chirurgie, les animaux seront hébergés individuellement pendant la période de cicatrisation, qui ne dépassera pas 7 jours.

La souris représente le modèle animal le mieux adapté pour notre recherche. Il offre en effet le meilleur moyen pour tenter de reproduire la maladie étudiée de manière contrôlée. Nous pourrons aussi examiner en détail les effets sur le cervelet, une région du cerveau qui semble particulièrement atteintes chez les patients. Grâce à ces souris, nous pouvons gérer quand et où la mutation apparaît dans les organes. Pour notre étude, nous utiliserons des souris à différents âges, de la naissance à l’âge adulte. Cela nous aidera à comprendre les conséquences développementales de l’expression de la mutation, notamment en regardant des aspects comme la taille, le poids, les caractéristiques physiques inhabituelles, les problèmes de mobilité, l’apparition de crises d’épilepsies et les troubles de l’équilibre.