Validation preclinique d’une administration trans papillaire rénale par ureteroscopie d’un vecteur viral de thérapie génique.

— La cystinurie est une maladie rénale qui aboutit à l’insuffisance rénale suivies de dialyse/transplantation. Bien que l’incidence de la cystinurie soit faible (≈1/7000), les calculs de cystine sont très récurrents et entraînent une morbidité importante : interventions chirurgicales fréquentes et lésions rénales dans près de 80% des cas. La précipitation de cystine est la seule manifestation de cette maladie rare, qui se traite par des mesures diététiques visant à obtenir des urines non sursaturées en cystine. Une information du patient et un suivi diététique pour réduire les aliments riches en méthionine, à boire >3L/j. Malheureusement, malgré un régime diététique efficace, plus de 85% des patients récidivent. Il existe des traitements médicamenteux qui visent à modifier la cystine urinaire pour la rendre incapable de former des cristaux mais, ces médicaments sont associés à des effets secondaires. — Dans le contexte du développement thérapeutique de maladies rares, et notamment rénales, nous avons identifié un vecteur viral de thérapie génique qui permet le transfert de gène dans les parties malades du rein grâce à une injection dans les voies urinaires, en direction des reins. Dans le cadre d’une preuve de concept, le mode opératoire pour une telle administration a été réalisé chirurgicalement. Nous souhaitons dès lors, nous pencher sur des indications thérapeutiques et commencer par explorer l’usage atraumatique de la voie endourologique, c’est-à-dire en passant par les voies naturelles. Ceci est rendu possible par l’utilisation d’un urétéroscope flexible (endoscope souple, fin, équipé d’une microcaméra et d’instruments à son extrêmité) ammené jusqu’au centre des reins pour délivrer le vecteur de thérapie génique. Cette méthode est cliniquement pertinente et peut-être réalisée en ambulatoire – couramment utilisée en clinique pour détruire des calculs ou retirer des tumeurs rénales. Cette validation préclinique est indispensable pour la constitution à terme d’un dossier d’essai clinique de thérapie génique et nécessitera donc l’utilisation du modèle porc étant donné la similitude anatomique des voies urinaires avec l’Homme. En conclusion, notre projet repose sur l’usage du porc pour la validation du protocole d’administration en vue de la constitution d’un dossier d’essai clinique de thérapie génique dans une indication en néphrologie.

****Opportunités thérapeutiques : La confirmation que l’emploi d’un urétéroscope flexible permet d’atteindre ces résultats ouvrirait de multiples opportunités pour traiter un ensemble important de maladies rénales originaires du néphron, tels que la cystinurie ou encore la polykystose rénale. ****Sécurité thérapeutique : éviter les effets secondaires : La validation de la méthode d’administration par urétéroscope permet de concentrer le vecteur de thérapie génique dans l’organe cible (ici les reins) limitant ainsi la circulation sanguine et les effets secondaires comme ont pu en être observés dans le cas de thérapies géniques contre la myoptahie de Duchenne par exemple. ****Mode d’administration raffiné : une fois validée l’administration par les voies naturelles offrira aux patients un traitement rapide, non invasif, précis et ne nécessitant pas d’hospitalisation.

Sur la durée du projet, les animaux subiront les interventions suivantes : -4 à 5 prises de sang (selon les groupes d’animaux) sous sédation ce qui représente une injection intramusculaire du sédatif d’une durée de moins d’une minute. La prise de sang dure environ 2 minutes. La sédation complète dure environ une demi-heure. -Un traitement immunorégulateur (pour éviter le rejet de la thérapie génique) qui se présentera sous la forme d’une injection intramusculaire par semaine (durée moins d’une minute) et de la prise de comprimés quotidienne qui seront mélangés à un aliment ou une boisson appétente. -1 à 2 procédures d’administration de vecteur de thérapie génique (selon les groupes d’animaux) qui se déroulent sous anesthésie générale. L’anesthésie inclut une injection intramusculaire pour la sédation (durée de moins d’une minute). L’animal est ensuite inconscient pour le reste de la procédure. La procédure totale sous anesthésie dure entre 1h30 et 2h, selon qu’un seul rein ou deux sont traités. -A la fin du projet (au bout de 3 à semaines selon les groupes) : les animaux feront l’objet d’une dernière anesthésie générale (injection intramusculaire de moins d’une minute), la suite de la procédure se déroule sous anesthésie générale. Au cours de celle-ci une chirurgie sera réalisée afin de réaliser des prélèvements d’organes. L’animal sera ensuite mis à mort, toujours lors de cette anesthésie générale.

La plupart des actes se dérouleront sous sédation ou sous anesthésie générale. Ainsi, les cochons vont recevoir une injection de sédatif en intramusculaire. Nous prenons nos dispositions pour que l’injection soit la moins stressante, la moins douloureuse et la plus courte possible. Lorsqu’une anesthésie est prévue, sous sédation, un cathéter intraveineux sera posé sur une veine de l’oreille, l’animal étant profondément sédaté, il n’y a que peu de réaction à cet acte qui dure environ une minute. La suite de la procédure se déroule sous anesthésie générale maintenue par un respirateur fiable permettant de nous assurer de l’absence de toute souffrance. Pour les injections intramusculaires du traitement immunomodulateur, là aussi, nous prenons nos dispositions pour que l’injection soit la moins stressante, la moins douloureuse et la plus courte possible. La prise de comprimés ne présente pas de contrainte pour les animaux grâce au mélange dans un aliment ou une boisson appétente.

L’ensemble des animaux est mis à mort en fin de projet car une autopsie doit être réalisée afin d’étudier l’effet de la thérapie génique sur les reins post mortem.

Compte tenu que le but du projet est de démontrer l’emploi d’un urétéroscope flexible pour délivrer un vecteur viral de thérapie génique par les voies naturelles, il ne peut y avoir d’alternative à l’usage d’un modèle animal. Après administration intra-rénale du vecteur de thérapie génique, il sera nécessaire de maintenir l’animal en vie afin de pouvoir évaluer le niveau et la distribution de l’expression du gène transféré. Ainsi, nous ne pourrions substituer l’utilisation d’un animal vivant.

****Stratégie de Réduction: Ce projet se découpe en une Phase pilote incluant 6 porcs suivie d’une Phase de Consolidation incluant 14 porcs. La Phase Pilote aura la particularité d’injecter les 2 reins d’un même animal permettant ainsi de diviser le nombre d’animaux par 2. En fonction des résulats obtenus à l’issue de la Phase Pilote, la Phase de Consolidation n’injectera qu’un seul rein sur les deux afin de disposer d’un rein contrôle non exposé au vecteur de thérapie génique. Cependant, compte tenu qu’au cours de la Phase Pilote, les injections seront restreintes soit à la partie supérieure soit inférieure du rein, il est possible que le pôle rénal non directement exposé puisse servir de tissu contrôl interne. Auquel cas, là également, nous pourrons exploiter les 2 reins chez un même animal et ainsi diviser le nombre total d’animaux par 2. Il faudra donc attendre l’issue de la Phase Pilote avant de pouvoir décider la meilleure option pour promouvoir la Réduction du nombre d’animaux. ****Statistiques: cette étude ne prévoit pas d’analyse statistique des résultats. Il s’agit d’une étude qualitative qui est destinée à tester quelques paramètres d’injection car nous sommes en mode exploratoire. Une fois nous aurons identifiés les paramètres et conditions clés, une seconde session incluera des ‘n’ plus conséquent pour confirmer et valider les conditions optimales d’injection.

Conditions d’hébergement : Les porcs sont réceptionnés au sein de l’animalerie où ils sont acclimatés et hébergés en groupe sociaux dans de larges box enrichis de jeux à mâcher et de balles, avec des conditions d’ambiances contrôlées. Ils sont douchés quotidiennement à l’eau tiède et un programme de familiarisation basé sur la distribution de récompenses facilite les interactions avec les soigneurs et réduit leur stress lors des manipulations. Un programme musical apaisant est diffusé pour couvrir les bruits d’ambiance aversifs. Conditions expérimentales : L’urétéroscopie par les voies naturelles est justement choisie comme méthode d’administration des vecteurs de thérapie génique car cette voie n’est pas invasive. En effet, en clinique humaine, l’urétéroscopie ne nécessite pas de prise en charge particulière après l’examen. De plus, cet examen mobilisera l’intervention d’un urologue spécialisé dans cette pratique chez des patients humains mais également lors d’enseignements sur des porcs pour former des chirurgiens à cette abord chirugical non-invasive. Les animaux sont anesthésiés et recevront des analgésiques pour toutes les procédures et ils font l’objet d’un suivi au réveil afin de s’assurer qu’ils ont bien récupéré de leur anesthésie. Nous travaillerons de manière aseptique (matériel stérile, à usage unique ou stérilisable, champs stériles, tenue stérile de l’opérateur et du chirurgien, désinfection cutanée et des muqueuses) afin de pouvoir éviter les risques infectieux et garder en vie pendant 3 à 4 semaines l’animal injecté sans que sa fonction rénale et son état général n’en soit affectés. L’usage d’une antibiothérapie de couverture en peropératoire et posopératoire immédiat permettra également d’éviter les risques infectieux. Des points limites sont définis pour arrêter la procédure en cas de souffrance.

Afin que l’étude que nous proposons ait une pertinence forte pour ensuite déposer un dossier de demande d’essai clinique aux agences réglementaires ad hoc, l’espèce animale doit permettre d’évaluer précisément la procédure d’administration du traitement avec un équipement identique et un protocol adapté à celui déjà utilisé chez les patients humains. Il faut également que l’anatomie de l’espèce animale et de l’organe ciblé soient similaires à l’homme. Le porc est donc la seule espèce qui nous permettra une validation préclinique de la procédure d’injection. Des porcs de 3 mois environ (soit 40-50 kg) seront utilisés. A ce stade de développement, le système urinaire du porc est très proche de celui de l’humain tant du point de vue anatomique que du point de vue de sa taille, permettant ainsi de se positionner dans les mêmes conditions que celles de la thérapie chez l’Homme.