Etude du Syndrome Nephrotique Idiopathique (SNI) sur la souris.

Le syndrome néphrotique idiopathique (SNI) est la forme la plus fréquente des maladies rénales de l’enfant et de l’adulte jeune. Ce syndrome est caractérisé par la survenue brutale d’oedèmes généralisés liés à une fuite urinaire massive de protéines (protéinurie) entraînant une perte importante de protéines du sang, en particulier de l’albumine. Les oedèmes sont souvent associés à une hyperlipidémie et une hypercoagulabilité sanguine. Bien que la majorité des patients réponde favorablement au traitement de première intention par les corticoïdes, le taux de rechute avoisine les 80%, et un traitement à long-terme, qui associe les corticoïdes à d’autres immunosuppresseurs, est souvent nécessaire pour maintenir la rémission, ce qui est délétère pour les patients compte-tenu des effets secondaires néfastes de ces traitements. La cause exacte du SNI reste inconnue. Les études génétiques récentes n’ont pas permis d’identifier des anomalies structurales de gènes. Actuellement, l’hypothèse la plus étayée par les différentes études clinico-biologiques concernant ce syndrome, notamment la réponse aux traitements immunomodulateurs et/ou immunosuppresseurs, est celle d’une pathologie du système immunitaire dont certaines cellules, encore non identifiées, pourraient sécréter un facteur soluble plasmatique contribuant à l’induction du défaut de perméabilité des glomérules rénaux à l’origine de la protéinurie. Dans de précédentes études, il a pu être démontrer in vivo, sur des modèles murins, que la surexpression de Cmip précèdait l’apparition de la protéinurie selon des mécanismes qui restent à élucider. Il a été identifié, chez les patients atteints de SNI, cette même protéine CMIP, dont l’expression est particulièrement augmentée au cours des poussées de la maladie, dans les lymphocytes T et les podocytes du glomérule rénal. Actuellement, la fonction de cette protéine reste inconnue, d’où l’objet de ce projet. Comprendre la fonction de CMIP dans le système immunitaire permettra d’ identifier les mécanismes par lesquels, la surexpression de CMIP dans les lymphocytes T, induirait le développement d’un SNI. Les résultats attendus constitueraient une avancée majeure dans la compréhension de cette pathologie et pourrait permettre d’identifier une nouvelle cible thérapeutique potentielle. (A noter que la nomenclature internationale désigne C-Maf inducing Protein humaine par CMIP et celle de souris par Cmip)

Lors de la phase de poussée du SNI, l’expression de CMIP est détectée dans le système immunitaire (lymphocytes) et dans le rein (podocytes). Il a pu être démontré, par l’utilisation de souris transgéniques, que l’expression de Cmip dans les lymphocytes engendrait des perturbations du système immunitaire. Ces phénomènes précèdent l’apparition de la protéinurie. Les mécanismes impliqués dans ces perturbations ne sont pas connus et leur élucidation pourrait permettre de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques dans cette maladie. L’élucidation de la fonction de CMIP permettrait une grande avancée dans la compréhension des dysfonctions immunitaires induites par la surexpression de cette protéine.

Au cours de l’expérimentation, Les souris donneuses recevront une injection intrapéritonéale (qui dure 10 secondes par souris) tous les deux jours pour un total de 3 injections, puis elles sont sacrifiées et les lymphocytes T prélevés pour être injectés en IV (qui dure 30 secondes par souris) sous AG dans les souris receveuses qui recevront une injection IP tous les deux jours pour un total de quatre avant le sacrifice

Pour l’ensemble des procédures, les animaux ne subissent que des injections. Ces injections, hormis la douleur de la piqure n’induiront aucune autre souffrance et n’auront pas d’autre incidence sur leur condition de vie.

Les animaux sont systématiquement euthanasiés en fin de procédure afin de prélever les organes dans le but de préparer des cellules d’intérêts.

Le gène CMIP est de découverte récente et son implication dans les maladies humaines reste inconnue. Il est peu exprimé voire indétectable chez le sujet sain. En revanche, il est fortement exprimé dans certaines pathologies dysimmunitaires humaines en particulier le syndrome néphrotique idiopathique (SNI) où il est surexprimé dans les lymphocyte T CD4 qui sont impliqués dans la maladie. Pour l’instant, sa fonction est inconnue. La seule stratégie pour comprendre comment il agit pour entraîner des désordres immunitaire à l’origine du SNI, est de l’invalider in vivo (éteindre l’expression du gène) et analyser les conséquences sur la fonction du lymphocyte T par rapport aux souris contrôles (qui expriment normalement le gène). La compréhension de la fonction de CMIP dans le lymphocyte T est primordiale si on veut élucider les mécanismes immunopathologiques du SNI

Le nombre de souris par lot a été déterminé dans une étude pilote sur des souris contrôle non traitées. Ces souris ont été euthanasiées, les organes prélevés et les lymphocyte T préparés. Le phénotypage des lymphocytes T a été effectué par cytométrie. Nous avons utilisé le test de Mann-Whitney pour comparer les différentes sous-populations de lymphocytes T avec leur phénotype spécifique, ainsi que le taux de cellules nécessaires pour une analyse transcriptomique. Nous avons ainsi estimé le nombre de souris à traiter pour pouvoir finaliser toutes les études, qui doivent être réalisées (immunoselection, immunofluorescence, préparation de protéines et d’ARN) à partir des cellules extraites de ces souris. Le nombre d’animaux pour chaque procédure a été réduit au maximum tout en garantissant la qualité et la significativité des résultats.

Les animaux sont hébergés par lot de même sexe sans dépasser le nombre de 5 animaux par cage ni d’animaux seul dans une cage. Ils ont à disposition de l’eau et des aliments à volonté et l’enrichissement est constitué par l’apport de papier compressé, d’un refuge en cellulose et de Sizzel-dri (enrichissement foisonnant à base de papier Kraft). Les souris sont surveillées visuellement 2 à 3 fois par jour au cours des procédures. Les points limites à l’expérimentation sont décidés en cas de souffrance ou de détresse, insensibilité aux stimuli, prostration, troubles respiratoires, hypothermie. Dans ces conditions, et en accord avec le code de l’expérimentation, les souris seront euthanasiées.

CMIP est une protéine clé dans l’apparition de la protéinurie aussi bien chez l’homme que chez la souris. Nous avons choisi la souris car elle est reconnue comme modèle dans l’étude du SNI. Au cours d’études précédentes, nous avons généré des lignées de souris transgéniques qui sur-expriment Cmip dans les lymphocytes et les podocytes mais également des lignéesinvalidées pour le gène CMIP que nous utilisons dans ce projet Nous utiliserons des souris adultes entre 8 et 10 semaines car le système immunitaire est mature chez la souris à ces âges.