Modèle murin de gliomes/glioblastome par greffe orthotopique chez la souris immunodéficiente ou immunocompétente : mise au point et études d’efficacité

Les différents types de gliomes sont des cancers au pronostique sombre qui touchent préférentiellement les enfants et adolescents (cancer pédiatrique). Le gliome a pour origine les cellules gliales du cerveau et est représenté par 3 types majeurs : l’astrocytome, l’épendynome et l’oligodendrogliome. Le glioblastome est une des formes agressives du gliome malin dérivant du sous- type astrocytome à un stade 4. Le gliome est un cancer localisé dans le cerveau ce qui confère une difficulté supplémentaire de part cette localisation pour l’accès des traitements à la zone malade. La thérapie du gliome/glioblastome repose sur une ablation chirurgicale aussi étendue que possible, une radiothérapie et, pour certaines tumeurs, une chimiothérapie. L’exérèse de la zone tumorale est rarement curative et nécessite de poursuivre la thérapie. Ainsi, il est important de développer de nouveaux traitements pour ce cancer afin d’améliorer la survie et la qualité de vie des patients. Dans le cadre de la recherche de nouveaux médicaments, après avoir été sélectionnés grâce à des tests in vitro, les composés de recherche sont évalués in vivo chez des souris porteuses de tumeurs humaines greffées sous la peau pour y déterminer leur activité et leur efficacité anti-tumorale vis-à-vis de la cible. Pour autant, la localisation des gliomes ajoute une complexité thérapeutique qui est de passer la barrière hématoencéphalique. En complément, un modèle orthotopique de greffe de cellule (différentes lignées de type gliomes ou glioblastomes) dans le cerveau sera induit par stéréotaxie de manière à complexifier le modèle d’étude et recréer une tumeur dans son site primaire. Cette localisation spécifique constitue une barrière physique aux traitements et permet aussi l’ajout du microenvironnement tumoral spécifique de ce type de tumeur. Ce projet sera réalisé avec différentes lignées tumorales rendues bioluminescentes (exprimant la luciférase) de manière à obtenir des modèles d’études pertinents et dont la croissance est compatible avec le suivi des traitements. L’activité anti-tumorale de traitements candidats sera ensuite évaluée sur ces différents modèles à l’aide d’un suivi par un système d’imagerie in vivo permettant de visualiser la bioluminescence appelé IVIS. La mise en place d’un ou plusieurs modèles orthotopiques de gliomes va permettre d’évaluer de manière plus pertinente des candidats médicaments pour ce type de tumeurs dont la localisation est un frein au progrès thérapeutique.

Actuellement, les études pharmacologiques pour les pathologies du gliome et du glioblastomes sont réalisées sur de modèles de xénogreffes de cellules tumorales humaines sous la peau de souris (greffe ectopique ou hétérotopique). Mais ces modèles ne récapitulent pas toutes les caractéristiques spécifiques associées à ces pathologies qui sont localisées dans le cerveau. Notamment il existe une différence au niveau du microenvironnement tumoral mais également au niveau de la sélection des médicaments car sur des modèles sous cutanés il n’est pas possible de sélectionner la capacité des médicaments à passer la barrière hématoencéphalique et aller interagir avec la cible au site de la pathologie. En complément de ses modèles de routine néanmoins utile, la greffe de cellules tumorales de type gliomes/glioblastomes dans le cerveau de souris permet d’enrichir le microenvironnement tumoral, d’ajouter la barrière physique qu’est la barrière hématoencéphalique et est donc considérée plus pertinente pour l’évaluation de nouveaux traitements anti-tumoraux. Il est bien décrit que le modèle orthoptique montre une bonne réponse aux traitements actuellement administrés aux patients que sont la chimiothérapie et la radiothérapie. L’objectif est de compléter les modèles existants qui seront gardés pour les premières phases de tests des produits (efficacités ou activité) et permettront de ne sélectionner que les produits prometteurs à tester sur ce modèle orthotopique. Le modèle orthotopique est essentiel pour évaluer l’activité et l’efficacité des produits candidats dans un contexte de passage de barrière hématoencéphalique. Ainsi les bénéfices de ce projet seraient de mettre au point un modèle plus prédictif de la pathologie humaine et ainsi de mieux prédire l’efficacité de candidats médicaments chez l’homme.

Intervention chirurgicale (stéréotaxie) sous anesthésie générale gazeuse et locale avec analgésie (45 min de la préparation de l’animal et fin de chirurgie) – 1 fois Imagerie IVIS sous anesthésie gazeuse (20min) – 1 fois par semaine jusqu’à 6 fois au cours de l’étude Prélèvement sanguin vigile (microsampling) jusqu’à 6 fois durant 2 min de contention et 30s de prélèvement Injection d’analgésie, anesthésique et de produit à tester en IP (intrapéritonéale), SC (sous-cutanée), PO (orale), IV (intravéneuse) vigile pouvant aller jusqu’à plusieurs jours consécutifs, durant 30s, 2 min pour IV Prélèvement sanguin terminal par ponction intracardiaque sous anesthésie gazeuse, puis dislocation cervicale – 1 fois Prélèvement final (perfusion du cœur) sous anesthésie générale injectable (Ketamine Xylazine), analgésie – 1 fois

Une potentielle source de stress ou douleur légère à modérée peut provenir lors : − Douleur modérée : de la phase chirurgicale (stéréotaxie)nécessaire à l’administration des cellules (d’une durée d’environ 30 minutes) et du suivi post-opératoire. – Douleur modérée : de la phase de pousse de la tumeur. Un suivi quotidien permettra de mettre en évidence l’éventuelle douleur et les points limites comme la perte de poids qui sera limitée à 20% maximum du poids de l’animal (100 jours maximum). − stress et douleur légère : de l’administration de composés testés réalisée par voie sous cutanée, intrapéritonéale, intraveineuse ou per os. La contention de 30s et l’injection d’environ 10s peuvent également générer du stress. − stress et douleur légère : des prélèvements de sang au niveau de la veine marginale de la patte. La contention d’une durée maximale de 2 min ainsi que le prélèvement (moins de 30s) peuvent générer du stress. − des signes cliniques observables associés à l’injection des composés (troubles du comportement, altération de l’état général). – de l’anesthésie gazeuse pour l’évaluation de la taille de la tumeur par de l’imagerie (IVIS) d’une durée de 20 min hebdomadaire maximum. – des injections d’analgésiques lors du sacrifice de fin d’étude réalisées en SC, IP. La contention de 30s et l’injection d’environ 10s peuvent également générer du stress.

Lorsqu’un point limite est atteint, l’animal concerné est alors euthanasié. A la fin de chaque étude, tous les animaux sont euthanasiés pour réaliser des prélèvements de sang, de tumeur et d’autres organes (si d’intérêt pour analyse). Ces prélèvements seront réalisés pour générer des échantillons qui pourront être utilisés pour des études ultérieures (détermination de l’expression de protéines ou de gène d’intérêt, par immunohistochimie, génomique ou protéomique…) ou pour des analyses de biomarqueurs dans le cadre des études d’efficacités.

Ce projet a pour but de mettre au point un modèle de greffe orthotopique chez la souris de cellules tumorales de cellules de la glie. L’implantation des cellules dans le cerveau permet ainsi à la tumeur de se développer dans le microenvironnement d’origine d’un cancer du cerveau permettant ainsi une récapitulation des nombreuses caractéristiques de la pathologie humaine. De plus, cette localisation ajoute une complexité au développement du médicament qui se doit d’avoir des propriétés physico-chimiques spécifiques pour atteindre la tumeur et franchir la barrière hématoencéphalique tout en interagissant avec la cible. Il est impossible à l’heure actuelle de reconstituer in vitro les interactions d’une tumeur avec le micro-environnement, et donc il n’y a pas de méthodes substitutives. En amont de l’activité vivo un screen vitro sur BBB (Blood Brain Barrier dit barrière hématoencéphalique en français) test de passage de la barrière hématoencéphalique sera réalisé. Des campagnes d’environ 10 composés seront réalisés et les produits capables de passer la barrière seront sélectionner pour être testés vivo sur des modèles orthotopique pour vérifier leur activité sur les cellules tumorales et la cible. Cela permettra de diminuer le nombre de produits à tester in vivo.

• Un accompagnement par le service biostatistique sera réalisé pour estimer la variabilité de la pousse de la tumeur pour chaque lignée cellulaire étudiée dans le cadre de ce projet. Cette étape permettra d’établir le nombre d’animaux nécessaires par groupe pour les études futures d’efficacité de traitement et de pharmacodynamie en évaluant la robustesse des designs de ces études à sera utilisé pour évaluer l’efficacité des candidats médicaments. • Lorsque les souris seront euthanasiées, des prélèvements de tumeurs seront réalisés pour générer des échantillons qui pourront être utilisés pour des études ultérieures (détermination de l’expression de protéines ou de gène d’intérêt, par immunohistochimie, génomique ou protéomique…). Cette approche permet donc d’optimiser les études et de Réduire le nombre d’animaux en évitant de refaire des études pour obtenir des échantillons. • Dans les phases d’entrainements, les premiers essais se feront sur des souris non utilisées sorties d’autres études (issues d’autres projets) afin de maitriser le/les site et les volumes d’injections avant de valider le geste sur des souris dédiées au projet. De plus la mise au point des techniques et sélection de la plus pertinente se fera par un seul expérimentateur expérimenté à la chirurgie et à la stérotaxie afin de Réduire le nombre d’animaux. Ensuite le second expérimentateur sera formé par le premier sur des animaux issus des 320 cités pour mise en place des 8 modèles (en plus des souris non utilisées sorties d’études). • De plus, afin d’inclure toutes les souris greffées nous utiliserons l’imagerie pour randomiser tous les animaux au fur et à mesure du développement de la tumeur sur la base d’un volume tumoral similaire permettant ainsi de maximiser le taux d’inclusion. • Lors des études d’efficacité de candidats traitements, il sera possible d’effectuer des analyses de pharmacocinétique c’est-à-dire d’évaluer, en fonction du temps, le devenir d’un médicament dans l’organisme (via des prélèvements sanguins de faibles volumes et répétés au maximum sur 6 points) évitant la réalisation d’une seconde étude dédiée.

•La procédure de greffe orthotopique est réalisée selon les bonnes pratiques de chirurgie sous anesthésie générale gazeuse et avec analgésie pré, péri et post-opératoire, avec à un maintien de la température corporelle dès l’anesthésie jusqu’au réveil total de la souris. •Les souris seront placées en hébergement seule après la chirurgie jusqu’au lendemain matin suivant la chirurgie (max 18h) afin de suivre individuellement leur récupération post chirurgie vis-à-vis du processus de nidification. •L’habitat des souris est enrichi de matériel adapté pour leur permettre d’exprimer leurs instincts naturels comme ronger (bâtonnet de bois), se réfugier (tube ou dôme) ou nidifier (cocoon, sizzle dry) et de l’aliment est distribué dans la cage pour favoriser le comportement de fouissage. •Les animaux font l’objet d’une observation clinique en post chirurgie et tout au long de l’étude par les expérimentateurs et par les zootechniciens pour s’assurer de leur rétablissement, de leur bien-être et de l’absence de signe clinique. En cas de signe clinique (comme la perte de poids et le dos vouté), le vétérinaire est alerté et les recommandations de la SBEA et les points limites seront appliqués. • Les animaux peuvent être hébergés dans des cages connectées. Ce mode d’hébergement permet de mettre en évidence le changement de comportement à la suite du développement de la tumeur cérébrale. Pour certains modèles de glioblastomes les signes cliniques connu en plus de la perte de poids sont une démarche modifiée, la rotation ou l’inclinaison de la tête et des étapes de ralentissement des mouvements. Changements capturables par les cages connectés dont l’analyse des résultats permettra une meilleur documentation des modèles et des réponses aux médicaments. • Le suivi de la croissance tumorale par l’imagerie sous anesthésie gazeuse est une méthode non invasive pour l’animal et sans douleur qui permet de suivre un même animal tout au long de l’étude sans procéder à l’examen macroscopique de la tumeur en systématique. Les tumeurs sont mesurées par l’IVIS 1 fois par semaine, à la fois pour l’objectif de l’étude mais aussi pour limiter la souffrance et appliquer les points limites Des prélèvements par microsampling peuvent être mis en œuvre afin d’obtenir des informations complémentaires comme le profil d’exposition plasmatique.

En oncologie, l’utilisation de la souris est largement décrite dans la littérature pour la recherche pré-clinique. De plus, la greffe orthotopique de cellules tumorales dans le cerveau chez la souris est couramment utilisée dans les études précliniques d’oncologie. Ainsi la souris est le modèle de choix. Les souches utilisées seront des souris immunodéprimées présentant un phénotype dommageable pour permettre la prise de greffe de cellules humaines d’intérêt. Les souris sont utilisées à l’âge adulte, à partir de 7 semaines. Il s’agit de l’âge d’utilisation classique des souris dans les protocoles d’efficacité et de pharmacodynamie en oncologie.