
Résumé non technique d'un projet d'expérimentation animale, reproduit depuis ALURES
("EC NTS/RA identifier" : NTS-FR-306126)
Objectifs et bénéfices escomptés du projet
Décrire les objectifs du projet.
L’objectif de notre projet est d’explorer les mécanismes moléculaires permettant la différenciation des cellules souches sanguines, appelées cellules souches hématopoïétiques (CSH), notamment vers la différentiation en globules blancs. Les CSH, résidant dans la moelle osseuse, sont des cellules à longue durée de vie dotées d’une capacité d’auto-renouvellement, nécessaire pour renouveler les différentes cellules composant le sang. En raison de ces caractéristiques, les CSH doivent relever le défi de maintenir un équilibre délicat entre auto-renouvellement et différentiation extensive pour reconstituer les cellules sanguines épuisées. Cet équilibre délicat est crucial pour maintenir l’homéostasie et répondre aux demandes évolutives de l’organisme. Les mécanismes impliqués dans la différenciation des CSHs ne sont pas totalement compris. De par nos résultats antérieurs, le facteur de transcription MafB pourrait jouer un rôle dans cette différenciation. Nous avons montré que les CSH possèdent la capacité de conserver une mémoire des signaux infectieux précédents. Cette mémoire, caractérisée par un ensemble de modifications épigénétiques, a été appelée « immunité entraînée ». Ce phénomène a des implications significatives dans la mise en place d’une seconde réponse adaptée à la suite d’un même stimulus. Nos résultats suggèrent que le facteur MafB 1/ joue un rôle dans la différenciation des CSHs en condition homéostatique et inflammatoire (notamment en favorisant la production des cellules myéloïdes (hématies, polynucléaires, monocytes et plaquettes en urgence), 2/ serait impliqué dans la mécanistique de mise en place de la mémoire entrainée des CSH. Alors que MafB est une protéine qui intéragit avec elle-même, dans certains contextes inflammatoires, elle peut former un complexe avec un autre facteur Fos qui pourra potentiellement impacter la différenciation des CSHs et la mise en place mise en place de la mémoire entraînée. Notre projet aura donc pour objectifs: 1/ l’étude du rôle de MafB dans les mécanismes impliqués dans la différenciation des CSHs en conditions homéostatiques ; 2/ l’étude du rôle de MafB dans les mécanismes impliqués dans la différenciation des CSHs en conditions inflammatoires de type myélopoïèse d’urgence et dans l’immunité entrainée au niveau des modifications épigénétiques induites par la primostimulation, 3/ la capacité des CSHs à reconstituer totalement une moelle osseuse en absence de MafB ou en présence du complexe MafB/Fos
Quels sont les bénéfices susceptibles de découler de ce projet?
L’étude de la différenciation des CSHs présente de nombreux bénéfices potentiels, tant pour la recherche fondamentale que pour les applications cliniques. Sur le plan scientifique, elle permet de mieux comprendre les mécanismes moléculaires et cellulaires qui régulent la transformation des CSH en différents types de cellules sanguines, notamment les hématies, les polynucléaires, les monocytes et les plaquettes. Cette connaissance approfondie pourrait aider à identifier des dysfonctionnements immunitaires responsables comme par exemple des formes graves du SARS-Cov2 ouvrant ainsi la voie à de nouvelles stratégies thérapeutiques modulant l’activité de ces cellules. En clinique, une meilleure maîtrise de la différenciation des CSH pourrait améliorer les thérapies cellulaires, notamment les greffes de moelle osseuse, et favoriser le développement de traitements régénératifs pour réparer les tissus endommagés. En outre, ces avancées pourraient contribuer à la création de thérapies personnalisées, en optimisant l’utilisation des cellules souches pour répondre aux besoins spécifiques des patients. Finalement l’immunité entrainée représente un concept novateur et sa modulation une alternative thérapeutique en tant que solution de Remplacement aux antibiotiques en favorisant la création de vaccins à large spectre.
Nuisances prévues
À quelles procédures les animaux seront-ils soumis en règle générale?
Cette procédure a pour but de produire les animaux d’intérêt utiles au projet à savoir des souris issues des lignées MafB flox CSF1R Cre, MafB flox Vav1 Cre, MafB Flox Vav1 Cre PU1 KI GFP et MafB Flox/MafB E269R Vav1 Cre. D’après nos études précédentes, nous considérons qu’environ 3% des animaux necessiteront un second génotypage fait par prélèvment caudal (–28 jours et sera effectué sous anesthésie gazeuse isofluorane 4%. Le génotypage du modèle PU1 KI GFP se fait de par l’analyse de la protéine PU1 KI GFP présente dans les souris issues de la lignée MafB Flox Vav1 CRE PU1 KI GFP par analyse sanguine en cytométrie en flux. Pour cela, un prélèvement sanguin d’un volume de 100µL effectué en retro-orbital sera effectué sur des souris âgées de 5-7 semaines. . Certaines souris pourront subir en vigile injection intra-veineuse qui entraine une légère douleur de courte durée pour l’injection d’un traceur avant mise à mort, Certaines souris recevront une stimulation inflammatoire soit en injection intra-veineuse dans le sinus rétro-orbital sous anesthésie gazeuse soit en injection intrepéritonéale sur animaux vigiles. Les souris subiront un prélèvement sanguin (entre 1 et 4 prélèvements séparés d’une semaine) au niveau du sinus rétro-orbitaire sous anesthésie gazeuse puis une injection intrepéritonéale unique pour l’injection d’un traceur avant mise à mort. Pour les stimulations inflammatoires, cela varie de 1 à 3 jour en fonction du type de stimulation. Certaines souris subiront une myéloablation par irradiation aux rayons X sur animaux vigiles (quelques 5 min) puis une transplantation en injection intra-veineuse dans le sinus rétro-orbital sous anesthésie gazeuse d’une suspension de cellules de moelles osseuses. Les souris subiront un prélèvement sanguin (entre 1 et 4 prélèvements séparés d’un mois) au niveau du sinus rétro-orbitaire sous anesthésie gazeuse puis une injection intrepéritonéale unique pour l’injection d’un traceur avant mise à mort. Les injections ou prélèvements entrainent une légère douleur de courte durée (quelques minutes) localisée au niveau de la zone d’injection ou de prélèvements.
Quels sont les effets/effets indésirables prévus sur les animaux et la durée de ces effets?
La myéloablation peut rendre les animaux plus susceptibles aux risques infectieux. La répétition des gestes techniques et l’inconfort que peut ressentir l’animal après une injection mimant une infection ou après une myéloablation pourront engendrer une souffrance modérée. Les souris pourront présenter une fatigue, une légère hypothermie et une perte de poids pendant 2 jours (injection mimant une infection) ou 15 jours (transplantation suivant une myéloablation). Les animaux peuvent présenter des signes de stress liés à leur contention
Justifier le sort prévu des animaux à l’issue de la procédure.
Animaux conservés pour la suite des procédures après la procédure 1 (excepté pour les réproducteurs) et mise à mort pour les autres procédures.
Application de la règle des "3R"
1. Remplacement
Afin d’étudier le potentielle rôle du gène MafB dans la régulation de la différenciation des cellules souches hématopoiétques, nous ne pouvons pas Remplacer le modele murin. En effet, les cellules souches hematopoiétiques étant particulièrment régulées par leur environement, d’un point de vue physique via des interactions directes cellules-cellules mais aussi de part l’ensemble des médiateurs chimiques régulant leur communication, l’utilisation de lignée cellulaire est impossible. Ne pouvant donc pas Remplacer le modèle murin, nous réduirons autant que possible leur utilisation.
2. Réduction
Sur la base de nos données préliminaires, nous calculerons le nombre minimum de souris nécessaires pour chaque expérimentation permettant d’obtenir un résultat statistiquement significatif (calcul du n avec un test unilatéral pour une différence de 10%, un risque alpha de 5%, une puissance bêta de 80%). Nous avons également choisi de comparer les groupes de souris génétiquement modifiées avec leurs contrôles de même portée respectifs et non avec des souris de type sauvage.
3. Raffinement
Les expérimentations seront optimisées dans l’optique de Réduire, supprimer ou soulager l’inconfort, la douleur ou l’angoisse subie par les souris afin d’améliorer le bien être de l’animal pour obtenir des données fiables. Une anesthésie générale sera utilisée durant les procédures expérimentales (prélèvement sanguin et transplantation). Nous vérifierons l’état de santé des souris quotidiennement : tout changement dans leur comportement ou l’apparition de signes cliniques (posture, prostration, difficultés à se déplacer et à s’alimenter, déshydratation) sera relevé et évalué grâce à une grille d’évaluation de la douleur. Lorsque les souris présenteront une perte de poids supérieure ou égale à 20% de leur poids maximum ou si le score de la grille de douleur atteint 10-12, soit le cas sévère, les animaux seront alors mis à mort. Durant l’ensemble de l’étude, les souris seront hébergées dans des conditions conformes à la réglementation européenne en vigueur (environnement contrôlé : température et ventilation régulées, lumière avec un cycle de 12h, hygrométrie), avec un accès continu à la nourriture et à l’eau. Les souris seront maintenues en groupes de 3 à 5 animaux par cage. L’environnement est enrichi par des dômes en carton ou du coton.
Expliquer le choix des espèces et les stades de développement y afférents.
Mammifères dont 99% des gènes sont orthologues à l’homme. Animal de petite taille et à reproduction rapide. Bonne connaissance anatomique, physiologique et biologique de ce modèle. Disponibilité de modèles génétiquement modifiés nécessaires aux études réalisées dans ce projet. Les animaux seront utilisés entre 8 semaines et 2 ans sachant qu’il n’est pas exclu que l’impact de la délétion de MafB évolue au cours du vieillissement.