Impact du rythme circadien et des régimes alimentaires sur la susceptibilité à l’infection bactérienne

Le rythme circadien, influencé par la photosensibilité et le comportement alimentaire, joue un rôle régulateur dans divers processus physiologiques, notamment au niveau intestinal. La barrière intestinale peut être fortement perturbée les régimes riches en graisses ou en sucres qui sont connus pour perturber l’horloge biologique. Il s’en suit une réaction en chaine qui conditionne la susceptibilité post-prandiale aux maladies infectieuses comme cela est observée chez les patients atteints d’obésité. En particulier, des études viennent de mettre en évidence que ces alimentations (dé)favorisent la colonisation par certaines bactéries commensales ayant la capacité de moduler la surveillance immunitaire et la résistance à la colonisation par des pathogènes. Dans ce contexte, un intérêt tout particulier de notre étude réside résolument dans notre capacité à documenter dans le détail la réponse anti-infectieuse post-prandiale en réponse à ces alimentations riches en graisses ou en sucres qui favorisent l’obésité. Nos résultats pourraient ainsi ouvrir aujourd’hui des pistes d’intérêt pour la recherche sur les graves complications du surpoids et de l’obésité.

L’utilisation d’agent infectieux permettra d’élucider les mécanismes favorisant ou limitant le pronostique de l’infection à Salmonella Typhimurium, en réponse à un régime hypercalorique. Cela permettra à plus long terme de proposer de meilleures approches thérapeutiques aux patients atteints de plusieurs comorbidité comme l’obésité.

Prélèvements fécaux : sur animaux vigiles, ramassage dans la cage d’une durée 1 à 2 min par souris, de manière hebdomadaire. Prélèvements sanguins pour test glycémies et insulinémies : sur animal vigile, prise de sang d’une durée de 10 à 30 secondes, 8 mesures par test étalé sur 2h, 2 fois au cours de la vie de l’animal (1 de chaque). Prélèvements sanguins pour suivi métabolique : sur animal anesthésié, prise de sang unique d’une durée de 30 secondes, de manière hebdomadaire, pendant 8 semaines. procédure de gavage pour colonisation microbienne et test de perméabilité intestinale : sur animaux vigiles maintenu par contention afin de ne pas les blesser et ajuster le geste de gavage à leur déglutition/respiration et à tout signe potentiel de douleur. Le gavage dure 4-5 secondes environ. 1 fois durant la vie de l’animal, 2 fois si greffe fécale en plus.

A) Les régimes riches en gras et/ou sucres sont susceptibles d’entraîner une prise de poids, affectant la mobilité. Mesures envisagées : Un suivi de l’apparence physique externe de l’animal (moustaches, museau, yeux, pelage), une pesée des animaux hebdomadaires et avec un suivi de la consommation de nourriture et d’eau et de signe clinique mesurable (respiration, amorphe, diarrhée) seront effectués. En cas d’accès réduit à l’eau et à la nourriture, des biberons d’eau et des croquettes seront mis à dispositions à hauteur de souris. Il est à noter qu’aucune obésité morbide n’est attendu dans ce protocole. B) Les injections et prélèvements sanguins peuvent être douloureux. Mesures envisagées : Des seringues d’injection avec des gauges les plus élevés seront utilisées pour limiter la douleur. Les prélèvements seront espacés d’une semaine pour cicatrisation. Les cicatrices seront désinfectées. C) Les manipulations répétées peuvent induire du stress. Mesures envisagées : Les animaux seront manipulés par les mêmes expérimentateurs (formés et 2 max) quelques jours avant l’expérimentation pour adaptation et à heure régulière tout au long de l’expérience. Un suivi de l’apparence physique externe de l’animal (moustaches, museau, yeux, pelage) et de signe clinique mesurable (respiration, amorphe, diarrhée) seront également effectués. D) Les effets de l’infection à Salmonella Typhimurium, comme la perte de poids et les modifications des selles et un risque de mortalité, peuvent être observés. Mesures envisagées : Les animaux seront observés quotidiennement par les expérimentateurs. Afin de limiter la souffrance des animaux, une grille de notation avec un score a été établie. Un score cumulé de 5 ou plus ou une perte de poids de plus de 20% entraînera l’euthanasie immédiate des animaux.

euthanasie des animaux nécessaires aux prélèvements et aux analyses

Pour la réalisation de ce projet, l’utilisation d’animaux vivants est indispensable pour étudier le rythme circadien et son impact sur l’homéostasie des tissus et la flore intestinale. En effet, les relations entre l’apport alimentaire, le microbiote, la réponse immunitaire anti-infectieuse sont autant de facteurs s’adaptant aux différents moments de la journée, ne peuvent pas être reproduites dans d’autres systèmes tels que la culture in vitro ou ex vivo de cellules ou même d’organoïdes.

Afin de Réduire le nombre d’animaux avec une puissance statistique suffisante, des lots de 8 souris seront utilisés avec une charge infectieuse préalablement établie. Ce nombre est justifié sur la base d’expériences préliminaires montrant la variabilité inter-individuelle qui influence notamment la puissance des tests statistiques de comparaisons inter-groupes. Afin de Réduire la douleur, la souffrance et l’angoisse, les animaux seront surveillés quotidiennement par des personnes formées avec un suivi de l’apparence physique externe de l’animal (changement de comportement et perte de réponse comportementale au stimulus externe), de la nourriture et d’eau et de signe clinique mesurable (respiration…) sera réalisé. En parallèle, l’apparence physique externe de l’animal sera observée afin de déceler des signes de diarrhée, ainsi qu’un éventuel changement de comportement et perte de réponse comportementale au stimulus externe.

Les souris seront manipulées par des personnes formées (au maximum deux), notamment quelques jours précédant l’expérimentation, afin qu’elles s’habituent à l’expérimentateur et ainsi de Réduire le stress. Les manipulations se feront à la même heure chaque jour, ceci afin d’établir une habitude pour les animaux. La manipulation des animaux se fera dans une salle de manipulation séparée de la salle d’hébergement. Les animaux seront hébergés au sein de la plateforme d’expérimentation et de haute technologie animale ou par défaut dans un des isolateurs de l’Institut Pasteur de Lille (eau et aliment standard ad libitum (ou restreint le jour ou la nuit selon les protocoles), cycle jour/nuit 12h/12h, 23 °C). Les animaux sont individualisés avec une boucle d’oreille par le fournisseur, et maintenus dans des cages de 4 à 5 individus, en portoirs ventilés (Etiquetage informatisé des cages individuelles). Afin de Réduire la douleur, la souffrance et l’angoisse, les animaux seront observés quotidiennement à la recherche de signes classiques de souffrance par des personnes formées, avec un suivi de l’apparence physique externe de l’animal (moustaches, museau, yeux, pelage seront surveillés), d’un changement de comportement (perte de réponse comportementale au stimulus externe), une pesée des animaux et avec un suivi (en début et fin de journée) de la consommation de nourriture et d’eau et de signe clinique mesurable (respiration, amorphe, diarrhée, automutilation). Si une détérioration de l’état d’un animal est observée, une grille de notation sera réalisée. Si une perte de poids supérieure à 20 % survenait, les souris en souffrance seraient immédiatement mises à mort. Il est à noter qu’il ne pourra pas être utilisé d’analgésique ou d’antalgique, car ces traitements interfèrent avec la réponse inflammatoire intestinale et anti-infectieuse. En effet, les molécules anti-inflammatoires non stéroïdiens et les opiacés modifient la susceptibilité aux infections.

L’infection par les pathogènes murins que nous utilisons est permise en ayant recours au modèle animal ‘souris’ sous fond C57BL6/J. Nous utilisons cette espèce ainsi que ce fond génétique car les modèles KO que nous possédons sont sous fond C57BL6J. Les procédures commenceront entre 6 et 12 semaines d’âge des souris pour permettre à la composition du microbiote intestinal de se stabiliser et au système immunitaire d’être à maturité.. Les protocoles d’infection peuvent durer jusqu’à 3 semaines. L’induction de l’obésité par le régime durent jusqu’à 8 semaines.