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Etude de l’hypoxie chez un modèle de souris mutante

Types de recherche
Recherche fondamentale et Système cardiaque
Mots-clés
fonction cardio-vasculaire et Hypoxie
Souris : 40
Souffrances
sans réveil0
légères20
modérées20
sévères0
Devenir
Mise à l'adoption0
Reproduction (ou relâché si sauvage)0
Réutilisation0
Devenir non indiqué40

Objectifs et bénéfices escomptés du projet

Décrire les objectifs du projet.

Nos cellules utilisent l’oxygène pour générer de l’énergie efficacement et, lorsqu’elles manquent soudainement d’oxygène, en cas d’hypoxie, des dommages irréversibles et rapides peuvent survenir aux organes. L’hypoxie chronique a également des conséquences, plus particulièrement dans les tumeurs, qui peuvent contribuer à des métastases et au décès. Il existe des mécanismes qui permettent aux cellules de s’adapter à l’hypoxie, dont l’élément-clé est la voie sensible à l’oxygène qui implique le facteur de transcription HIF-1. Ce mécanisme de base est une découverte fondamentale et un élément central dans la compréhension de la détection de l’oxygène dans le corps. Plusieurs composantes supplémentaires ont été découvertes plus récemment, notamment des modificateurs de la structure de l’ADN, des régulateurs des signaux de dégradation, et des facteurs impliqués dans la détection aiguë de l’oxygène. Cependant, il reste de nombreuses autres composantes qui interviennent dans le traitement des conséquences de l’hypoxie et qui restent à étudier, dont le facteur de transcription ELK3. ELK3 intervient dans des voies de signalisation conduisant à la transcription de l’ADN, et joue un rôle dans la migration cellulaire, la formation de nouveaux vaisseaux sanguins (l’angiogenèse) et l’intégrité vasculaire. De plus, il a été démontré qu’il joue un rôle dans la régulation des gènes sensibles à l’hypoxie, la protéine ELK3 étant elle-même dégradée dans des conditions de faible teneur en oxygène. La plupart des mécanismes de signalisation induits par l’hypoxie impliquant les deux protéines ELK3 et HIF-1 sont distincts, mais liés. On s’attend ainsi à ce que ELK3, tout comme HIF-1, soit impliqué dans l’angiogenèse, des études in vitro en culture cellulaire ayant notamment montré qu’ELK3 est préférentiellement exprimé dans les cellules endothéliales qui tapissent la paroi des vaisseaux sanguins, mais aussi dans le mélanome. Cependant, il reste à élucider si ELK3 est impliqué dans la réponse physiologique à l’hypoxie. Dans ce contexte, nous souhaitons étudier les conséquences de la perte totale d’ELK3 dans le modèle souris, dans des conditions d’hypoxie, sur la fonction cardio-vasculaire et le remodelage vasculaire pulmonaire.

Quels sont les bénéfices susceptibles de découler de ce projet?

L’hypoxie joue un rôle important dans les causes de mortalité, notamment le cancer, l’ischémie myocardique et les maladies métaboliques, du cœur et des reins, ainsi que dans les maladies de la reproduction telles que la prééclampsie et l’endométriose. Il existe de nombreuses preuves provenant de systèmes in vitro selon lesquelles un ou des facteur(s) de transcription, joue(nt) un rôle essentiel dans la réponse hypoxique. Pour utiliser ces connaissances pour comprendre et finalement traiter les pathologies liées à l’hypoxie, nous devons étudier les rôles de ces facteurs dans un modèle animal. Les expériences prévues devraient apporter une preuve convaincante de son importance physiologique dans l’hypoxie, et nous permettre d’exploiter notre boîte à outils, notamment les molécules que nous avons développées ciblant l’un de ces facteurs de transcription, pour traiter à terme les pathologies associées à l’hypoxie.

Nuisances prévues

À quelles procédures les animaux seront-ils soumis en règle générale?

AMENDEMENT : un prélèvement sanguin a été effectué sur un 1er groupe de 10 mâles KO + 10 mâles contrôles à 8 semaines d’âge. Ce prélèvement a duré environ une minute. Les animaux reçoivent une injection de NaCl 0,9% d’un volume équivalent au volume de prélèvement et sont placés quelques minutes sur plaque chauffante. Après le prélèvement de sang, nous avons rencontré un problème matériel pour le test d’hypoxie et ce malgré le test préalable de l’appareillage. Les délais de livraisons des pièces et la réparation ayant été très long, la suite des expérimentations n’a pas pu se réaliser sur ce lot de souris. Afin de maintenir l’âge requis des animaux pour cette étude (à 10-12 semaines environ, où l’arborescence et la structure des vaisseaux sanguins seront matures), nous devrons générer un 2ième lot de souris (10 mâles KO ELK3 et 10 mâles contrôles WT). Les 20 animaux du nouveau lot seront soumis à 3 prélèvements sanguins (même conditions que décrit précédemment), à 2-3 semaines d’intervalle et à une échographie (durée environ 20 minutes). Ils seront soumis par ailleurs à des conditions hypoxiques (10% oxygène) pendant 2 semaines.

Quels sont les effets/effets indésirables prévus sur les animaux et la durée de ces effets?

Les prélèvements sanguins, ainsi que l’échographie pour explorer la fonction cardiaque peuvent entrainer un léger stress ou une douleur chez les animaux. Ils seront effectués sous anesthésie gazeuse. Par ailleurs, les souris seront exposées à des conditions hypoxiques pouvant également entrainer un léger stress, sans pour autant être nuisibles dans les conditions appliquées.

Justifier le sort prévu des animaux à l’issue de la procédure.

A la fin de la procedure, toutes les souris seront mises à mort pour réaliser une nécropsie et prélever des organes (coeur, poumons) en vue des analyses post-mortem

Application de la règle des "3R"

1. Remplacement

Le rôle de la protéine d’intérêt ELK3 dans le processus d’hypoxie a été étudié par des approches cellulaires dans notre laboratoire, mais pour analyser les effets globaux de cette protéine sur le muscle cardiaque, les vaisseaux sanguins et les poumons, le modèle souris nous semble nécessaire pour nous rapprocher au mieux de la pathologie humaine.

2. Réduction

Pour chacun de nos tests, nous comparerons le groupe contrôle sauvage et le groupe mutant Homozygotes ELK3. Approche statistique: grâce aux études précédentes et les données collectées sur les animaux contrôles sur plusieurs années, et en tenant compte des tests réalisés au cours de cette étude, nous savons que le nombre de 10 animaux par génotype est suffisant pour détecter des phénotypes spécifiques s’ils existent.

3. Raffinement

Durant toute l’étude, y compris en cages d’hypoxie, les souris sont hébergées à raison de 3 souris par cage afin d’éviter le stress lié à l’isolement et de maintenir les interactions sociales. Afin de limiter la gêne qui pourrait survenir suite à la baisse de la concentration d’oxygène celle-ci se fera progressivement (en 3 heures). L’exploration cardiaque est indolore, mais une anesthésie sera mise en oeuvre chez la souris afin d’éviter le stress lié à la manipulation, en particulier lors de l’épilation et de l’échographie. L’anesthésie facilitera en outre l’exploration en limitant les mouvements de l’animal. En cas de ralentissement du rythme cardiaque sévère lié à l’anesthésie, la procédure sera arrêtée et les animaux surveillés jusqu’au réveil dans les minutes suivant la procédure Si les animaux présentent une faiblesse trop marquée suite à l’anesthésie, une euthanasie pourra être pratiquée. Le prélèvement sanguin sera réalisé sous anesthésie gazeuse et sera limité à un volume de 25% du volume sanguin total de l’animal. Pour compenser la perte de volémie, nous injecterons par voie sous-cutanée un volume équivalent de solution saline (NaCl 0.9% chauffé à 37°C) après le prélèvement sanguin.

Expliquer le choix des espèces et les stades de développement y afférents.

La souris (Mus Musculus) est l’espèce de choix pour générer des modèles de maladies humaines. Son temps de génération permet de réaliser des études relativement rapides et de récapituler de manière assez fidèle les mécanismes chez l’humain. La nécessité d’utiliser des souris génétiquement modifiées est liée à l’absence de toute mutation spontanée dans cette espèce ou d’autres espèces de mammifères qui correspondrait à la maladie humaine. De plus, la génétique de la souris est bien connue et nous permet d’inactiver le gène d’intérêt specifiquement. Les souris auront 10-12 semaines environ (stade adulte), où l’arborescence et la structure des vaisseaux sanguins seront matures.