Analyse des mécanismes de colonisation et de dissémination de Enterococcus faecalis

Le microbiote intestinal forme un écosystème en équilibre composé de plusieurs milliards de bactéries représentant des milliers d’espèces. Si son effet bénéfique en santé humaine a été démontré, il est également considéré comme un réservoir de pathogènes opportunistes souvent résistants aux antibiotiques. Par exemple, les entérocoques sont des bactéries inoffensives du tractus digestif de l’être humain et des animaux. Bien qu’habituellement inoffensives chez l’être humain en bonne santé, certaines souches d’entérocoques sont à l’origine d’infections opportunistes chez des patients fragilisés. Nous cherchons à comprendre les mécanismes qui permettent aux entérocoques de proliférer au niveau intestinal et de disséminer dans l’organisme après avoir franchi la barrière intestinale. L’ensemble de ces recherches vise à générer des connaissances pour développer de nouvelles stratégies pour contrôler les agents pathogènes multi-résistants. L’objet de cette demande vise à caractériser les mécanismes par lesquels un pathogène opportuniste réussit à proliférer au niveau intestinal et à se répandre dans l’organisme après avoir franchi la barrière intestinale. Nous utilisons en première intention des approches de microbiologie classique sur la bactérie pathogène et des modèles cellulaires simplifiés. Le cas échéant nous avons besoin d’analyser les mécanismes l’infection de la bactérie d’intérêt dans un modèle complexe prenant en compte les interactions entre cette bactérie, l’organisme et le microbiote intestinal. Nos études reposent sur une modulation du microbiote intestinal en jouant sur sa composition à la suite d’un traitement antibiotique, et du système immunitaire de l’organisme en jouant sur son efficacité. Elles reposent également sur des analyses du pathogène en recherchant ce qui lui est nécessaire pour infecter et survivre dans l’organisme.

Une majorité des infections humaines est causée par des pathogènes multirésistants. La compréhension des mécanimes à l’origine de ces infections est un défi majeur. L’ambition de notre projet de recherche est de produire de nouvelles connaissances fondamentales afin d’améliorer notre compréhension des mécanismes qui permettent aux bactéries pathogènes présents dans le microbiote intestinal de causer une maladie. Nous nous intéressons en particulier à un entérocoque pathogène mais nous souhaitons tirer parti de notre savoir-faire pour renforcer la barrière contre d’autres pathogènes résistants aux antibiotiques. Ce projet représente donc un fort potentiel pour générer des connaissances permettant de développer de nouvelles stratégies préventives, thérapeutiques et de diagnostic contre ces agents pathogènes multirésistants, afin de limiter à terme l’utilisation d’antibiotiques en santé humaine et animale. Les bénéfices du projet seront i) de fournir des bactéries commensales qui pourront être utilisées pour permettre un retour à l’équilibre du microbiote intestinal chez les individus présentant un déséquilibre par exemple chez les personnes fragilisées ou âgées et ii) de fournir des gènes présents chez les bactéries multirésistantes pour proposer de les cibler et de diminuer leur pouvoir pathogène.

Les interventions soumises aux animaux sont les suivantes : – 1066 souris vigiles seront pesées au moins une fois. Parmi elles, 576 souris seront pesées 10 fois pendant 25 jours ; 460 seront pesées, soit deux fois sur une période de 72h maximum soit 9 fois sur une période de 21 jours. – 576 souris vigiles recevront une injection (durée < 1 minute), 1 fois par jour pendant 3 jours consécutifs, et un gavage 1 fois par jour, pendant 25 jours, (durée < 1 minute). - Les fèces seront prélevées sur 10 fois sur 576 souris vigiles sur une période de 25 jours. - 20 souris vigiles recevront deux injections < 1 minute - 10 souris vigiles recevront une injection < 1 minute - 460 souris anesthésiées recevront une à quatre injections, (durée < 1 minute), et un gavage, 1 fois (durée < 1 minute)

Les effets indésirables de l’anesthésie pourraient être l’hypothermie et l’abolition des réflexes comme pour avaler ou cligner des yeux. Les injections ainsi que la collecte de sang sont à l’origine d’une douleur peu intense et localisée au point d’injection. La fréquence des gavages et les prélèvements de fèces occasionnent un stress léger dû à la contention ou à l’isolement de la souris dans un pot le temps du prélèvement. L’utilisation de l’antibiotique pendant trois jours génère un inconfort digestif qui disparaitra après l’arrêt du traitement (pas de diarrhée constatée à l’issue du traitement avec cet antibiotique).

euthanasie pour analyses sur organes post-mortem

Les approches expérimentales chez la souris permettent d’intégrer la complexité des interactions entre le microbiote intestinal, l’organisme et le pathogène. A ce jour, aucune autre approche n’est disponible pour Remplacer ce type de modèle et « mimer » ces interactions. Les expériences réalisées in vitro et dans les modèles cellulaires bien que complémentaires à cette étude ne pourront Remplacer un modèle intégrant la complexité des interactions entre les cellules de l’organisme, le pathogène opportuniste et le microbiote. Il permet également d’intégrer la complexité des interactions entre organes et au niveau cellulaire et métabolique et immunologique. L’utilisation d’animaux vivants est par conséquent un outil essentiel à la caractérisation des mécanismes moléculaires pour la découverte de nouveaux antimicrobiens.

Afin de Réduire le nombre d’animaux, nous avons estimé le nombre d’individus à utiliser par groupe sur la base de nos précédents travaux et de la littérature. Dans les deux modèles d’infection que nous proposons d’utiliser, notre critère de jugement est lié à la quantité de bactéries présentes dans l’organisme. Nous avons évalué que le nombre total d’animaux par groupe nécessaire est égale à 32 et 20 pour obtenir des résultats significatifs.

Nous veillerons à ce que la réalisation de ce projet soit conforme aux exigences de raffinement liées à l’expérimentation animale. Les souris seront hébergées en petit nombre. Elles seront hébergées par 2 à 4. Les souris bénéficieront d’un enrichissement de leur environnement avec du papier cellulose, des maisons en carton et des bâtons à ronger (pour les procédures dont la durée > 48h) dans chaque cage car il diminue le stress de l’animal et facilite la thermorégulation de l’animal. Tout au long des procédures, les souris seront pesées et examinées régulièrement pour détecter des signes de détresse (changements dans la respiration, poil rêche comportement inhabituel, posture voûtée, perte de poids). Le temps de manipulation des souris vigiles sera minimisé au maximum afin de limiter le stress et l’angoisse des souris. Les gavages seront réalisés sur souris vigiles pour éviter les fausses routes et réalisés avec un volume réduit et des canules de gavage fines et courtes bien adaptées au modèle murin et à la taille de l’animal. Les gavages seront réalisés par la même personne, formée à cette technique, tout du long du protocole pour limiter le stress des animaux. Du gel oculaire sera déposé pour pallier aux effets de l’anesthésie. Le jour des prélèvements d’organes, les souris seront manipulées à distance des cages où seront hébergées les autres souris en attente d’être manipulées. Des points limites ont été définis.

Le modèle murin présente, en plus de qualités propres en terme d’expérimentation, plusieurs avantages pour l’étude des infections par des bactéries pathogènes car les pathologies sont similaires à celles que l’on peut observer chez l’être humain. Les différentes bactéries pathogènes étudiées sont capables de coloniser le tractus gastro-intestinal des souris, de proliférer et de disséminer via la circulation sanguine à la suite d’une rupture de l’équilibre du microbiote intestinal post-antibiotique comme cela est observé chez l’être humain. Dans cette étude conformément à nos travaux antérieurs, des souris « jeunes adultes mâles et femelles » âgées au minimum de 6 semaines seront donc utilisées. A cet âge, le microbiote intestinal est installé et le système immunitaire est fonctionnel. Leur poids devra être supérieur ou égal à 18 g.