Mise en place d’un protocole de cultures cellulaires primaires d’ostéoblastes et d’ostéoclastes à partir de prélèvements d’os et de moelle osseuse chez la souris C57Bl/6j irradiée ou non avec des rayons X.

Bien que l’utilisation des rayonnements ionisants dans le domaine médical, industriel ou militaire soit majoritairement maitrisée, des surexpositions accidentelles peuvent se produire. Ces expositions peuvent entrainer un syndrome cutané radio-induit se traduisant par l’apparition d’érythème, de desquamation ou de nécrose tissulaire, musculaire voire osseuse dans les cas les plus sévères. Afin d’avancer dans la connaissance scientifique des expositions accidentelles induites par des rayons X de basses énergies et de contribuer à l’amélioration de la prédiction du risque de complications, nous avons développé un modèle de brûlures radiologiques induites par des rayons X de basses énergies chez la souris (irradiation localisée de la patte). Afin de mieux comprendre les processus biologiques mis en place suite à une exposition avec ces rayons X de basses énergies pour lesquels le dépôt de dose est très hétérogène (Dtissu ≠ Dmoelle ≠ Dos), nous souhaitons mettre en place deux modèles de cultures cellulaires primaires, ostéoblastes et ostéoclastes, à partir de prélèvements faits chez la souris afin d’étudier l’impact de l’irradiation et du temps sur le devenir et les capacités de ces cellules. En effet, les ostéoblastes, d’origine mésenchymateuse, jouent un rôle clé dans la formation et la minéralisation de l’os tandis que les ostéoclastes, d’origine hématopoïétique, jouent un rôle clé dans la résorption osseuse.

Ce projet va permettre de mettre en place deux modèles de cultures cellulaires primaires à partir de prélèvements médullaires fait chez des souris irradiées localement avec des rayons X de basses énergies. Au-delà de la mise en place de ce protocole pour notre projet de recherche, à plus long terme, nous souhaitons grâce à ces modèles de cultures cellulaires primaires mieux comprendre les processus biologiques impliqués dans l’homéostasie osseuse suite à une irradiation.

Epilation des pattes sous anesthésie (environ 10 minutes) Irradiation patte arrière sous anesthésie (maximum 20 minutes) Scoring des lésions (contention, environ 1 minute) Tous les prélèvements seront réalisés post-mortem.

Dans le cadre de ce projet les animaux vont développer des brûlures radiologiques au niveau de la patte arrière. Ce modèle expérimental de gravité modérée nécessite une vigilance particulière en particulier au pic de la lésion. Sur la base de notre précédent projet, des résultats obtenus et le recul sur ce modèle une évaluation de la brulure radiologique basée sur du scoring lésionnel sera effectuée entre 7 jours et 30 jours après l’exposition (pic lésionnel) par des personnes formées à l’évaluation de ce type de lésions. L’irradiation localisée de la patte peut entrainer les signes suivants au niveau de la zone irradiée : œdème, desquamation, érythème, voire nécrose dans certains cas. Il s’en suit une cicatrisation qui peut conduire à une rétractation des tissus. Cette irradiation peut entrainer une mobilité moindre de la patte irradiée.

Tous les animaux seront mis à mort à la fin des procédures expérimentales afin de pouvoir collecter les tissus pour les cultures primaires et les analyses éventuelles.

Dans le but de mettre en place des cultures cellulaires primaires et d’étudier l’impact de l’irradiation sur ces cellules irradiées in vivo, l’utilisation d’un modèle « in vivo » demeure indispensable au bon déroulement des projets scientifiques mais le nombre de souris utilisé sera réduit autant que possible. Les utilisations d’animaux dans le cadre de ce projet seront tracées (date, projet concerné, informations sur les animaux, devenir des animaux, type d’irradiation). Tout événement non attendu sera également tracé, répertorié et des actions seront mises en place si nécessaire.

Ce projet prévoit d’utiliser au maximum 16 souris par groupe de dose et par temps. Comme nous allons procéder en étape Go / no Go l’intégralité des souris ne seront peut-être pas utilisées. L’objectif est d’avancer pas à pas afin d’utiliser le moins de souris possible pour la mise en place de ces cultures cellulaires primaires.

Les conditions de soins et d’hébergement des animaux seront adaptées aux procédures réalisées afin de limiter le plus possible le stress et la souffrance de l’animal. Les souris seront hébergées en groupe et dans un environnement enrichi. Lors des irradiations, des anesthésiques seront utilisés et une surveillance des animaux sera mise en place après les irradiations. Le bien-être animal sera également évalué en réalisant des pesées, des photos des lésions et un scoring lésionnel, basé sur l’observation des modifications des tissus, ainsi que la mise en place de points limites adaptés. Ce modèle expérimental de gravité modérée où des brûlures radiologiques vont être développées au niveau du membre inférieur nécessite une vigilance particulière. Sur la base de notre expérience, de notre précédent projet, des résultats obtenus et le recul sur ce modèle, un suivi journalier sera effectué entre 7 jours et 30 jours après l’exposition correspondant au pic de la lésion. Des croquettes pourront également être déposées au fond de la cage avec de l’eau gélifiée afin de faciliter l’alimentation des animaux si des souris perdaient beaucoup de poids durant le pic lésionnel.

La souris est un modèle bien caractérisé et qui est le plus utilisé pour les études physiologiques. De plus, le modèle de lésions musculo-cutanée radio-induites a été précédemment caractérisé pour des irradiations avec des rayons X de basse énergie au sein de notre. Le mise en place de ces cultures cellulaires primaires fait suite à ces deux projets afin de mieux comprendre l’impact de l’irradiation sur les ostéoblastes jouant un rôle clé dans la formation osseuse et la minéralisation et les ostéoclastes impliqués dans la résorption osseuse. Pour les besoins de ce projet, des animaux adultes seront utilisés (8-10 semaines). Ce stade a été choisi afin d’éviter une hétérogénéité liée à l’âge. De plus, en vieillissant, les souris C57BL/6J ont tendance à développer des comportements agressifs.