Evaluation de l’efficacité de lots de produit pharmaceutique d’une molécule thérapeutique dirigée contre une toxine végétale en vue de sa mise sur le marché

La toxine d’origine végétale, cible de ce projet, est classée dans la liste des agents bioterroristes des CDC (Centers for Diseases Control and Prevention) aux Etats-Unis. Sa disponibilité dans la nature et sa facilité d’extraction font de cette toxine une arme de bioterrorisme, et de nombreuses tentatives ayant pour objectifs son utilisation à des fins malveillantes ont été répertoriées notamment en France à Paris en 2018 ainsi qu’en Allemagne à Cologne en 2023. A ce jour, aucun traitement n’est disponible commercialement. Une contre-mesure médicale a été développée et il est maintenant nécessaire d’utiliser un test de contrôle de qualité pour garantir que chaque lot de produit pharmaceutique fini possède les caractéristiques d’efficacité revendiquées. Le projet présente deux objectifs majeurs : 1) Contrôler l’efficacité de lots de produits pharmaceutiques administrés à la dose cible dans un modèle in vivo, à la suite d’une intoxication avec la toxine végétale. Ce premier objectif va permettre le contrôle qualité de l’efficacité et donc la libération de lots de produits pharmaceutiques selon les exigences réglementaires. 2) Le deuxième objectif est de répondre à la demande globale de Remplacement des techniques de contrôle de qualité de l’efficacité in vivo (seule technique pertinente aujourd’hui pour la toxine) par une technique in vitro. Il est indispensable, pour sa recevabilité réglementaire, de démontrer que la technique in vitro est fortement corrélée avec la technique in vivo pour le contrôle de l’efficacité thérapeutique des lots de produit pharmaceutique. Le prérequis de cette démarche de Remplacement est donc de disposer d’un nombre de données vivo/vitro suffisantes pour démontrer la corrélation des techniques nécessaire au dépôt du dossier d’enregistrement.

L’objectif premier du projet est de contrôler l’efficacité de différents lots de produit pharmaceutique d’une molécule thérapeutique en utilisant un modèle murin d’intoxication par une toxine végétale. Dans le contexte de la classification de cette toxine végétale comme agent de bioterrorisme et l’absence de traitement, le bénéfice attendu est la mise sur le marché d’un traitement contre les intoxications à cette toxine. Cette technique in vivo d’intoxication dans le modèle murin, seule technique fiable pour contrôler l’efficacité d’une molécule thérapeutique contre cette toxine, va permettre de répondre aux requis réglementaires de contrôle de l’efficacité du produit pharmaceutique dans le cadre de l’enregistrement de cette molécule thérapeutique et sa mise sur le marché. De plus, elle permettra la libération des lots de produits pharmaceutiques de cette molécule thérapeutique au cours des années. Le second objectif du projet est de démontrer la corrélation des techniques vivo/vitro pour la mesure de l’efficacité de lots de produits pharmaceutiques. Le bénéfice attendu de cet objectif est de pouvoir Remplacer, dès que possible, la technique in vivo par une technique in vitro. Plusieurs techniques sont en cours d’évaluation et les mesures obtenues in vitro seront comparées, pour les mêmes échantillons, aux données obtenues par le modèle de référence in vivo. Si l’une des techniques in vitro démontre une corrélation suffisamment robuste avec les données de la technique in vivo, et si ce niveau de corrélation est accepté par les autorités réglementaires, elle sera alors utilisée en Remplacement de la technique in vivo.

Des prélèvements de sang et des injections (intoxication à la toxine et administration des anticorps) seront réalisés sur les animaux. Ces manipulations pouvant entrainer des perturbations du bien-être animal, elles seront réalisées sur des animaux anesthésiées. Les prélèvements sanguins seront au nombre de deux et seront réalisés rapidement (30 à 60 secondes). Le volume prélevé sera adapté au poids de l’animal et toujours réalisé sur animaux anesthésiés. L’intoxication et l’administration des anticorps ne sera réalisé qu’une seule fois et ce fera de manière rapide (30 à 60 secondes).

Les effets indésirables (douleur et stress) liés aux gestes associés à la procédure (injections et/ou prélèvements) seront limités car réalisés sous anesthésie générale. Les effets indésirables associés à l’intoxication sont une perte de poids, une mobilité réduite, des difficultés respiratoires ainsi que des douleurs associées aux destructions tissulaires en lien avec les effets de la toxine pouvant entraîner la mort de l’animal. Ces effets indésirables sont pris en compte dans la définition des points limites. L’objectif premier de ce projet étant le contrôle qualité d’une contre-mesure médicale, à priori efficace. La majorité des souris seront traitées avec cette contre-mesure, limitant les effets de l’administration de la toxine.

A la fin de cette procédure, l’ensemble des animaux seront euthanasiés. Les animaux ne peuvent être réutilisés dans une autre procédure étant donné la présence de la toxine.

A ce jour, aucun modèle in vitro ou in silico n’est capable de prédire à 100% l’efficacité des molécules thérapeutiques lors de l’intoxication par cette toxine végétale. En effet, il existe des disparités entre les résultats obtenus par les méthodes actuelles in vitro et ceux obtenus in vivo. Nous avons ainsi pu observer qu’une molécule apportant une très bonne neutralisation à l’échelle d’une lignée cellulaire dans le modèle in vitro avait une efficacité très modérée in vivo. Ainsi, les mécanismes d’action des molécules thérapeutiques contre cette toxine peuvent être multiples et un effet à l’échelle cellulaire ne reflète pas toujours un effet sur un organisme entier. A ce jour, il est donc nécessaire de passer par des modèles plus complexes pour contrôler l’efficacité de lots de produit pharmaceutique, prenant en compte la distribution de la toxine comme celle de la molécule thérapeutique, la réponse inflammatoire et immunitaire, comme c’est le cas avec des modèles murins. Le deuxième objectif de ce projet est de démontrer la corrélation entre la technique de contrôle de l’efficacité in vivo et de nouvelles techniques in vitro. Si la corrélation est suffisante aux requis réglementaires, la technique in vivo sera remplacée par une technique in vitro pour le contrôle de l’efficacité des lots de produit pharmaceutique.

Objectif 1 : Le nombre d’animaux utilisés pour contrôler chaque lot de produit pharmaceutique doit correspondre au nombre permettant de conclure que l’échantillon contrôlé a bien une efficacité supérieure à la spécification et différente du groupe placébo. La détermination de ce nombre minimum d’animaux a fait l’objet d’une analyse biostatistique qui tient compte les différentes variables du modèle. Cette analyse a permis de déterminer le nombre minimal d’animaux par groupe nécessaire pour comparer les taux de survie obtenus lors d’un test in vivo à la spécification d’efficacité du produit avec un niveau de confiance minimal requis réglementairement. Objectif 2 : Le nombre d’animaux utilisés pour démontrer la corrélation entre les techniques vivo/vitro doit correspondre au nombre permettant de s’assurer que la technique in vitro est fiable et robuste pour contrôler l’efficacité des lots de produit pharmaceutique. La détermination de ce nombre minimum d’animaux a fait l’objet d’une analyse biostatistique qui tient compte les différentes variables du modèle. Cette analyse a permis de déterminer le nombre minimal d’animaux par groupe nécessaire pour réaliser les analyses de corrélations entre les techniques vivo/vitro avec un niveau de confiance minimal requis réglementairement. Objectif 1 & 2 : Les groupes placébo seront mutualisés. Un seul groupe placébo sera utilisé pour chaque phase expérimentale incluant des groupes répondant à l’objectif 1 (avec plusieurs lots de produit pharmaceutique) et des groupes répondant à l’objectif 2 (avec plusieurs lots de corrélation).

Les animaux seront hébergés en cage collective afin de favoriser les relations sociales. Une hutte en carton ainsi qu’une feuille de cellulose seront également ajoutées pour maximiser le bien-être des animaux et leur permettre de faire leur nid. Les animaux seront également observés quotidiennement durant toute la durée des essais, et lors de l’ensemble des procédures par du personnel qualifié. L’ensemble des procédures sera réalisé sur animaux anesthésiés. Les points limites déterminés pour ces essais (notamment les signes cliniques) nous serviront à nous assurer du bien-être des animaux, et nous permettront d’éviter une souffrance trop importante. Lors des essais avec la toxine, des aliments hydratés seront ajoutés dans la cage pour éviter la déshydratation des animaux. L’utilisation d’anti-inflammatoires est impossible, du fait de leurs effets potentiels sur la survie et sur l’effet thérapeutique des molécules testées.

Le modèle murin est majoritairement utilisé et a été amplement validé pour l’évaluation d’activité de différentes contre-mesures médicales contre ricinecette toxine. Les souris utilisées sont adultes car elles possèdent à cet âge-là un système immunitaire mature. La facilité d’élevage et de manipulation des souris font de ces animaux un modèle adéquat pour faire ces essais. Par ailleurs, la petite taille des souris fait utiliser une dose de toxine qui est très inférieure à la dose toxique chez l’homme, ce qui constitue un facteur de sécurité pour les opérateurs qui manipulent la toxine.