Adaptation génomique et transcriptomique in situ du parasite Leishmania donovani en réponse à la Miltefosine

Le développement de parasites résistants à la molécule testée devient un problème de santé publique d’autant qu’il s’agit actuellement du principal traitement contre la leishmaniose viscérale. Les résultats des recherches conduites in vitro sur le développement de parasites résistants à cette drogue anti-parasitaire ne sont malheureusement pas transposables sur des parasites de terrain (isolés de malades ne répondant pas au traitement) suggérant qu’in vivo les mécanismes et les cibles conduisant à l’apparition du phénotype de résistance sont différents. Le principal objectif de ce projet est donc de nous donner les moyens de comprendre les mécanismes qui conduisent à l’apparition chez les mammifères de parasites résistants à la molécule testée.

Les mécanismes d’acquisition de résistance à la molécule testée in situ chez l’homme et l’animal sont encore très mal connus alors que des récidives à l’issu de ce traitement apparaissent. Les recherches réalisées à ce jour par des approches in vitro sont insuffisantes puisqu’elles ne nous permettent pas d’appréhender et de comprendre pourquoi les malades ne répondent pas au traitement. Par ce projet qui consiste à générer in vivo (chez les hamsters) des parasites résistants à la molécule testée et donc à se rapprocher des conditions de terrain, nous espérons être en mesure d’apporter des réponses à cette problématique de santé publique. En effet, les parasites résistants à la molécule testée ainsi générés seront analysés par séquençage de leur génome et de leur transcriptome. Cette approche duelle nous informera sur les signaux génétiques et les signatures transcriptomiques corrélant avec l’adaptation des parasites en réponse à la molécule testée et nous permettra d’identifier les réseaux d’interaction à l’origine de la réponse/résistance à la drogue. Au-delà de l’importance de ces résultats sur notre connaissance générale des mécanismes d’adaptation des Leishmania en réponse à un stress (molécule testée), si ces derniers sont validés avec des prélèvements provenant de patients/chiens en échec de traitement ils représenteront une avancée majeure dans la recherche sur les traitements anti-Leishmania.

A compter de l’inoculation des parasites, les animaux seront soumis à 3 types d’interventions : – Imagerie intra-vitale non invasive sous anesthésie générale, impliquant une injection intrapéritonéale préalable (15 minutes). Ce suivi sera réalisé au maximum 36 fois, avec un délai entre chaque mesure de 2 semaines minimum. – Pesée une fois par semaine (20 secondes), pendant toute la durée de la procédure soit entre 20 et 50 fois selon les groupes d’individus. – Gavage (20 secondes),1 à 14 fois selon les groupes sur toute la durée de la procédure.

L’inoculation des parasites aux hamsters se fera en intrapéritonéale après anesthésie légère des animaux par exposition à l’isoflurane dans une chambre d’induction. En absence de traitement par les drogues anti-parasitaires, les espèces de Leishmania viscérales vont coloniser principalement le foie et la rate des hamsters. Dans ce cas la première phase de la maladie est silencieuse et peut durer jusqu’à 6 mois selon les individus. Au-delà, le premier signe clinique de l’évolution de la pathologie est une stabilisation de la prise de poids suivi d’une perte progressive de poids. Cette perte de poids lorsqu’elle atteint la limite de 20% du poids maximal de l’animal s’accompagne souvent d’une Réduction de la mobilité voire de prostration et d’isolement dans la cage. Le traitement est délivré par administration intragastrique (gavage), pendant un maximum de 5 jours ce qui est source de douleur et inconfort de courte durée et de stress. Dans les cas de traitement de l’homme ou du chien pour lesquels l’administration de la drogue anti-parasitaire est répétée sur 28 jours des troubles digestifs ont pu être observés. Compte-tenu de nos connaissances sur le modèle hamster dans un contexte de traitement, la probabilité d’apparition de tels effets chez les hamsters est toutefois minime. Le suivi de la parasitémie par imagerie intra-vitale non invasive est réalisé sur des animaux anesthésiés par exposition continue à l’isoflurane. Toutefois, cette procédure nécessite une injection intrapéritonéale, source de douleur et inconfort légers de courte durée, lorsque les animaux sont endormis. La répétition de la mesure au cours du temps est potentiellement vectrice de stress chronique pour les animaux.

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure. Ils ne peuvent en effet être ni réutilisés, ni replacés, ni adoptés car la fin de la procédure implique la mise à mort des animaux pour réaliser le prélèvement des lésions ou organes internes sources de parasites nécessaire à nos analyses.

Deux raisons majeures quant au choix du hamster pour ce projet : – Le modèle murin est peu adapté pour les espèces de Leishmania viscérales,d’où le choix du hamster qui développe une pathologie proche de celle observée chez l’homme et rend possible la production en nombre des parasites à partir de la rate et du foie des animaux infectés. – Le traitement anti-Leishmania par la molécule testée est efficace avec une même posologie que celle de l’homme. C’est donc l’animal de choix pour toute recherche liée aux traitements anti-parasitaire. Les parasites seront inoculées aux hamsters entre la 5ème et la 6ème semaine soit avant la stabilisation de la prise de poids pour un animal non traité. En effet, l’un des premiers marqueurs révélateurs de l’initiation des dommages systémiques est la stabilisation dans la courbe d’évolution du poids, le second révélateur de la progression des dommages étant une perte pondérale. D’autre part, compte tenu de la durée de l’expérimentation il est important d’utiliser des animaux jeunes.