Utilisation de modèles transgéniques murins pour l’étude de la lymphomagenèse

Le lymphome folliculaire (LF) est un cancer des cellules immunitaires se développant au sein des ganglions. Cette pathologie, malgré des avancées thérapeutiques notables, reste à l’heure actuelle incurable et sa fréquence est en constante augmentation dans les pays industrialisés. Les cellules tumorales de LF se caractérisent par l’accumulation d’altérations génétiques. La première altération conduit à la surexpression de la protéine de survie BCL2, puis d’autres altérations additionnelles sont fréquemment observées. Ainsi les modèles murins que nous avons développés pour mimer le LF surexpriment la protéine BCL2 humaine et possèdent une altération fréquemment décrite chez les patients. Ces multiples anomalies présentes dans le LF favorisent la croissance tumorale et la résistance au traitement en agissant directement sur la survie ou la prolifération des cellules tumorales mais aussi en favorisant le dialogue des cellules tumorales avec les cellules qui l’entourent, les cellules du microenvironnement. Nos modèles murins permettent ainsi d’analyser le développement tumoral en étudiant la fonctionnalité des cellules tumorales et en caractérisant la composition du microenvironnement tumoral.

Nos travaux devraient permettre une meilleure compréhension des différents stades et acteurs de la lymphomagenèse.

1)- La majorité des animaux aura une administration par voie orale d’une molécule chimique à 3 reprises pour l’induction des altérations d’intérêt, ce geste prend quelques secondes. En parallèle, ces souris recevront à une fréquence mensuelle une administration intrapéritonéale pour stimuler leur système immunitaire, cette administration prendra moins de 30 secondes. Dans le cadre du suivi de ces animaux, des prélèvements de sang, dont la fréquence sera au maximum mensuelle et la durée de moins de 30 secondes, seront réalisés. Dans certains cas, de l’imagerie non invasive pourra être réalisée impliquant une administration intrapéritonéale prenant moins de 30 secondes. 2)- Une petite partie du projet sur des souris non transgéniques implique cette fois-ci une irradiation de 30 minutes des souris sous oxygène (évite le stress), puis une injection intraveineuse de cellules, réalisée en moins d’une minute, pour reconstituer les souris.

L’administration par gavage peut générer un stress, un inconfort, voire une fausse route créant une détresse respiratoire, c’est pourquoi elle ne sera réalisée que par des personnes qualifiées pour ce geste et sur animal vigil, diminuant ainsi drastiquement les fausses routes. En cas de fausse route, l’animal sera surveillé le temps de l’évacuation du liquide, l’animal vigil aura le réflexe d’évacuer par lui-même le liquide. Dans nos expériences précédentes, nous n’avons pas observé de stress lié à la répétition de ce geste de gavage. Pour les animaux transgéniques portant la double altération et conservés plus de 6 mois, on peut observer un développement tumoral qui reste généralement indolent (non douloureux) comme chez l’Homme ; cependant ces souris seront observées régulièrement afin de détecter l’apparition de signes d’affaiblissement (perte de poids, léthargie, dos courbé…). Concernant les souris ayant reçues une irradiation corps entier, une perte de poids en lien avec des diarrhées induites par l’irradiation peut être attendue.

A l’issue de chaque procédure, les animaux seront euthanasiés afin de prélever les organes d’intérêt qui seront rigoureusement exploités et analysés afin de recueillir un maximum d’informations.

La caractérisation des évènements géniques impliqués dans le développement du cancer que nous étudions (lymphome folliculaire) ne peut être réalisée que partiellement in vitro puisque les modèles de culture ne nous permettent pas encore de reproduire la complexité du microenvironnement tumoral (présence de tous les acteurs cellulaires impliqués et complexité 3D) alors que celui-ci est justement essentiel au développement de ce type de cancer. Même si nous travaillons en parallèle à développer des modèles 3D plus complexes et de plus en plus fidèles à la réalité afin d’avoir recours au minimum à l’expérimentation d’animaux, l’utilisation de modèles animaux est indispensable pour certaines étapes de nos recherches sur la lymphomagenèse.

Afin de Réduire le nombre d’animaux nécessaires, les expérimentations ont été mises en place de manière à utiliser le moins de souris possible tout en extrayant le plus d’informations. Les croisements principaux des souris pour l’élevage ont été conçus de manière à obtenir uniquement des souris qui pourront être expérimentées sans produire des souris de mauvais génotype à euthanasier. Lorsque des expérimentations différentes sont nécessaires pour l’analyse des différents types cellulaires, les organes non utilisés sur chaque souris expérimentée seront congelés pour des analyses complémentaires afin d’éviter d’avoir d’autres souris à expérimenter pour générer ces échantillons. Notre expérience précédente nous a permis de dimensionner les groupes de souris pour l’étude des stades tardifs par la connaissance du taux de développement tumoral. Enfin, lorsque cela était pertinent, un calcul d’effectif a été réalisé afin de définir la taille des groupes d’animaux permettant d’observer l’éventuel effet des mutations étudiées.

Les animaux sont élevés dans des conditions adaptées à savoir des locaux confinés, des portoirs ventilés, un environnement contrôlé (température, humidité, pression), avec alternance jour/nuit (12h/12h), accès à la nourriture et l’eau de boisson ad libitum, change des cages 1 fois/semaine, et hébergement en groupe avec respect de la densité recommandée. Ils bénéficient également d’un enrichissement constitué de coton et/ou « maisons » en carton afin de les stimuler, diminuer le stress et afin qu’elles puissent se construire un «nid». Afin de limiter le stress lié aux gavages et injections, une acclimatation à la manipulation sera réalisée (manipulation préalable sans administration dans la salle d’expérimentation) par les expérimentateurs. Pour l’irradiation des animaux, ils seront placés dans une boite de confinement afin de maintenir une asepsie maximum, et de l’oxygène sera administré dans cette boite en continu à l’aide de filtre pour éviter l’apparition de stress ou de l’inconfort aux souris. Egalement, dans ce projet, le Raffinement sera obtenu par : la mise au point de procédures rigoureuses, la formation du personnel, un suivi quotidien de l’état de santé des animaux, le suivi des signes cliniques et la détermination des points limites, et le recours aux procédures d’euthanasie dès que nécessaire.

La souris possède un système immunitaire proche du système humain. Les mécanismes de diversification du répertoire et de réponse à une stimulation antigénique sont similaires. De plus le modèle murin a déjà démontré sa pertinence pour reproduire les mécanismes de développement de nombreuses pathologies lymphoprolifératives humaines. Les souris transgéniques seront utilisées à partir de 12 semaines et jusqu’à 18 mois dans le cadre de la procédure la plus longue, ce stade a été déterminé afin de reproduire au mieux la pathologie humaine survenant tardivement et avec un développement s’étalant sur plusieurs années. Les souris sauvages seront utilisées à 6 semaines puisque ce stage jeune favorise une reconstitution post-greffe efficace.