Etude de la capacité d’un minétique synthétique de l’héparane sulfate à promouvoir la réparation et la régénération du tissu pulmonaire dans un monde murin de dommage alvéolaire diffus

Ce projet vise à développer une thérapie régénérative pour le traitement des lésions pulmonaires tels que celles observées dans le syndrome de détresse respiratoire aigue, les exacerbations aigues de maladies pulmonaires fibrosante ou dans les pneumopathies sévères. Nous envisageons l’utilisation de mimétiques de polysaccharides pulmonaires afin d’améliorer la réparation du tissu pulmonaire et de permettre une récupération fonctionnelle après une agression pulmonaire aigue. Les effets bénéfiques seraient principalement liés à la régénération du tissu lésé en restructurant le réseau de molécule formant l’architecture pulmonaire et en limitant la fibrose. Le projet explorera la capacité de notre molécule à Réduire l’inflammation, les altérations des mécanismes de formation de nouveaux vaisseaux et la fibrose. Cette thérapie a pour objectif d’éviter les séquelles de lésions pulmonaires aigues caractéristiques des dommages alvéolaires diffus.

La survenue de dommage alvéolaire diffus (DAD) est une véritable problématique dans l’évolution des maladies pulmonaires. La DAD est une réaction aiguë non spécifique du poumon commune au syndrome de détresse respiratoire aiguë chez au moins 50 pourcents des patients, mais aussi dans les exacerbations aiguës des maladies pulmonaires interstitielles fibrotiques, dans les pneumopathies sévères du COVID-19 ou dans d’autres conditions diverses, dues à une multitude d’agents nocifs (infections, médicaments, etc..). L’évolution clinique de la DAD peut être aiguë, définissant des formes sévères potentiellement mortelles de pneumonie interstitielle aiguë, ou subaiguë-chronique, qui, après un schéma histologique initial de DAD, évolue vers des pneumopathies interstitielles fibrosantes (PIF) ou une fibrose pulmonaire idiopathique (FPI) avec une fibrose interstitielle étendue et une hypertension pulmonaire. Au cours de ces phases, des enzymes sont libérées et vont dégrader des protéines impliquées dans l’architecture du tissu. L’hypothèse de recherche de ce projet est que la molécule administrée par voie intra-veineuse chez la souris présenterait un potentiel thérapeutique pour lutter contre les lésions pulmonaires aigues en permettant une cicatrisation de l’épithélium pulmonaire. Ainsi cet agent (1) remplacera le réseau de molécule formant l’architecture pulmonaire remodelée suite à l’induction des lésions (2) améliorera la formation de nouveaux vaisseaux et la récupération alvéolaire, et (3) diminuera significativement le processus inflammatoire.

La réalisation de ce projet nécessite l’induction de lésion pulmonaire aigue (72h). Dans un premier temps nous déterminons la dose optimale de toxine bactérienne nécessaire pour induire des lésions pulmonaires. Pour cela les animaux anesthésiés recevront 1 instillation intratrachéale (durée 3 minutes) de cet toxine ou de sérum physiologique. Suite à cela nous déterminerons les effets d’injections intraveineuses unique ou multiple d’agent thérapeutiques (Animaux vigiles, durée quelques secondes). Le groupe contrôle (animaux vigiles) recevra une injection intrapéritonéale d’anti-inflammatoire (durée quelques secondes). Après une exploration fonctionnelle respiratoire (animaux vigiles, durée 1h) les animaux seront euthanasiés pour prélèvement d’organes (durée 10 minutes) afin de déterminer les mécanismes d’action de cet agent thérapeutique à 24h, 48h et 72h après induction des lésions pulmonaires. Enfin une étude du devenir de l’agent thérapeutique dans l’organisme (distribution dans les différents organes-10 minutes) sera réalisée à différents temps (5 min, 30min, 3h, 6h, 12h et 24h) après son administration par voie intra-veineuse.

L’administration de toxine bactérienne via la trachée est l’un des modèles de rongeurs les plus couramment utilisés pour induire des les lésions pulmonaires aigues. Dans ce modèle expérimental, le tissu pulmonaire est endommagé en 48 à 72h. Le modèle présente une réponse inflammatoire conduisant à des lésions au niveau des vaisseaux sanguins et alvéoles. Ces éléments sont des caractéristiques des patients atteints de lésions pulmonaires aigues. L’instillation par la trachée n’entraîne aucune lésion trachéale ni de douleur particulière au réveil de l’animal. Le développement de lésions pulmonaires est également indolore du fait de l’absence d’innervation sensitive à la douleur dans le tissu pulmonaire. Elle peut néanmoins entraîner une insuffisance respiratoire sévère et une mortalité plus importante. L’évaluation de la respiration de l’animal peut entrainer un stress. La contention lors des injections intrapériotnéales et intraveineuses peuvent induire un stress. Les injections IV répétées dans la queue des souris peuvent entrainer des blessures à la queue, des irritations, des saignements, une sensibilisation, des hématomes. Les injections intrapéritonéales peuvent entrainer des réactions au site d’injection et des lésions viscérales. Les anesthésies par voie intra-péritonéale sont suivies par l’euthanasie de l’animal (sans réveil). Lors de l’anesthésie gazeuse, les niveaux seront ajustés en temps réels afin d’éviter les risques anesthésiques.

A l’issue de chaque procédure, les animaux seront euthanasié pour prélèvement d’organes, du sang et du liquide de lavage broncho-alvéolaire. tous les prélèvements sont nécessaires pour répondre à la question scientifique.

La réalisation de ce projet nécessite l’induction de lésions pulmonaires in vivo. De fait, il n’existe pas de méthode alternative à l’expérimentation animale in vivo à ce jour. D’autre part, l’étude des mécanismes d’action d’un mimétique de l’héparane sulfate dans le cadre d’une thérapie matricielle peut-être plus facilement entreprise chez la souris du fait de l’existence d’outils permettant une approche mécanistique plus poussée.

Le nombre total d’animaux impliqué est de 2028. Le nombre d’animaux par groupe a été choisi sur la base de données, publiées ou non, et des calculs statistiques afin de définir le nombre d’animaux nécessaire pour obtenir un effet statistiquement significatif. Cela permet également de déterminer les points d’arrêt d’expérimentation les plus précoces et compatibles avec les objectifs du projet. Pour cela nous nous sommes basé sur la littérature existante ainsi que des tests de puissance et des statistiques issues de séries expérimentales précédentes prenant en compte les effets du lipopolysaccharide et la potentielle variabilité de nos paramètres physiologiques entre les différents individus.

Toutes les procédures seront réalisées dans le respect total des règles du Raffinement. Les souris seront hébergées dans un environnement enrichi par groupes sociaux de 4 animaux par cage. La température de l’animalerie et l’humidité relative sont contrôlés en permanence. La nourriture sera fournie ad libitum et la photopériode sera de 12h/12h. L’enrichissement du milieu sera composé de matériel de nidification (bandes de papier naturel compacté) et d’abri en cellulose. Concernant l’insitllation intra-trachéale, celle-ci sera réalisée sous anesthésie gazeuse. Ce type d’anesthésie est de courte durée et l’instillation n’entraîne aucune lésion trachéale ni de douleur particulière au réveil de l’animal. Les souris seront ensuite surveillées jusqu’a leur réveil complet. Afin d’améliorer le confort de l’animal suite à l’instillation intra-trachéale et afin de prévenir une perte de poids trop importante, un gel hydraté enrichi pourra être proposé au animaux afin de faciliter l’alimentation et la récupération des animaux dans les premières heures suivant la procédure. En fin de procédure, lors de l’anesthésie précédent l’euthanasie, la profondeur d’anesthésie sera vérifiées via l’observation des signes suivants: le relâchement des muscles, la perte du réflexe de retrait sur les deux pattes et la queue, la perte du réflexe de fermeture des paupiéres, une respiration calme. Durant toute la procédure, les conditions de soins et les méthodes utilisées ont été choisies pour Réduire le plus possible toute souffrance qu’auraient pu ressentir les animaux. Les points limites seront basés sur l’examen visuel des signes suivant: immobilité, difficultés respiratoires (râle, respiration rapide..), position anormale (dos vouté, couché sur le coté..), Réduction de la mobilité (faiblesse musculaire, manque de coordination, tremblements, paralysie..), perte de poids rapide ou progressive, mauvais état du pelage (poil ébouriffé, mal entretenu..), vocalisation, pâleur des yeux ou des extrémités, automutilation. Pour cela, une échelle d’évaluation avec score est utilisée.

Ce projet nécessite d’induire des lésions pulmonaires aigues, de réaliser des explorations fonctionnelles respiratoires et de prélever des tissus. Il n’existe donc pas d’alternative à l’utilisation d’animaux à des fins scientifiques dans notre contexte. Le modèle murins de lésions pulmonaires induits par une toxine bactérienne permet d’explorer les mécanismes de plusieurs pathologies respiratoires aigues. C’est un modéle validé dans la littérature et courament utilisé. Il est parfaitement décrit et fournit des informations utiles pour la découverte de nouveaux biomarqueurs et de nouvelles cibles médicamenteuses. Pour réaliser notre étude nous avons besoin que le système ventilatoire soit mature et fonctionnel. De plus, Le vieillissement augmente l’incidence et la mortalité du syndrome de détresse respiratoire aigu chez l’homme et les modèles animaux vont dans le même sens, les souris âgées présentant une augmentation de l’infiltration neutrophile et de la perméabilité alvéolo-capillaire après une exposition aux toxines bactériennes. Compte tenu de ces éléments et de la littérature existante sur le sujet, nous avons décidé d’utiliser des souris âgées de 8 semaines.