Validation d’un protocole de thérapie génique et essai pré-clinique dans un modèle murin pour une neuropathie fatale chez l’Homme

Ce projet concerne l’élevage d’une lignée de souris modèles d’une maladie neuromusculaire fatale chez l’Homme et pour laquelle il n’existe aujourd’hui aucun traitement, et le développement d’une thérapie génique pouvant constituer un traitement curatif pour cette pathologie. Cette maladie est provoquée par des mutations d’un gène, et cela entraine des troubles moteurs et sensoriels chez les patients dès l’enfance. La thérapie génique consiste donc à compenser le gène défectueux en important une copie du gène fonctionnelle dans l’organisme. Précédemment, nos collaborateurs ont développé un modèle souris qui reproduit pour la première fois les troubles moteurs et sensoriels retrouvés chez les patients. Nous avons élaboré une méthodologie avec ce modèle pour développer notre thérapie. L’objectif de cette étude est d’élever les animaux nécessaires pour pouvoir évaluer les bénéfices de ce protocole de thérapie génique grâce à un essai pré-clinique dans notre modèle sur une durée de 12 mois. Nous évaluerons ses bénéfices en évaluant le comportement et l’effet sur l’organisme de ces souris.

La validation de notre protocole et l’évaluation des bénéfices de notre thérapie génique chez la souris constituerait un premier pas vers une thérapie adaptable à l’Homme dans le cadre d’une maladie génétique rare (50 familles identifiées dans le monde). De plus, lors des analyses sanguines, nous aimerions pouvoir mettre en évidence des marqueurs sanguins de cette maladie. Ces marqueurs pourraient être utilisés également dans le cadre du diagnostic d’autres maladies neurodégénératives

Les animaux auront un prélèvement d’un petit fragment de queue pour connaitre leur patrimoine génétique (1min par animal, une seule fois). Une partie des souris recevront une injection intraveineuse (durée : 5mn) sous anesthésie générale. Une partie des souris auront 5 prélèvements sanguins maximum répartis sur 12 mois (durée : 5mn) au niveau de la veine sous mandibulaire sous anesthésie générale. Ces mêmes animaux réaliseront 5 fois une série de tests comportementaux moteurs et sensitifs (5 tests comportementaux répartis sur 5 jours, durée : entre 30s et 15mn par test) entre 1 mois et 12 mois. Ces tests permettront d’évaluer les capacités motrices et sensorielles des animaux permettant de rendre compte de l’efficacité de l’approche thérapeutique. Les animaux seront euthanasiés par une méthode règlementaire à la fin de la procédure.

L’injection intraveineuse, et les prises de sang par la veine sous mandibulaire pourront induire un stress faible chez les animaux et un léger inconfort au site d’injection ou de prélèvement respectivement. Un risque d’hypothermie et d’arrêt respiratoire lors des anesthésies reste possible mais très rare. Les tests comportementaux pourront induire un stress variable chez les animaux allant de faible à modéré. Un phénotype dommageable est développé par les souris à partir de 15 mois ce qui n’aura pas d’impact ici sachant que les souris sont maintenues jusqu’à 12 mois au maximum. Les animaux pourront ressentir une légère et brève douleur lors du prélèvement de queue pour connaitre leur patrimoine génétique.

les anciens reproducteurs et les animaux porteurs de genotypes non souhaités seront euthanasiés. Les animaux utilisés pour évaluer les bénéfices de la thérapie devront être euthanasiés pour le prélèvement d’organes post mortem pour l’analyse. Une partie des animaux produit sera en utilisation continue dans nos autres projets de recherche.

Le projet a pour but de valider un premier essai pré-clinique de thérapie génique pour une maladie neuromusculaire fatale et incurable chez l’Homme. Les modèles in vitro (cellules immortelles et neurones en culture) ont permis de mettre en évidence des effets au niveau moléculaire etcellulaire de cette approche. Cette approche thérapeutique nécessite d’être validée dans un organisme modèle de mammifère. Le tissu nerveux ne pouvant être accessible chez l’Homme et les essais thérapeutiques ne pouvant être testés directement chez l’Homme, il est essentiel de prouver l’efficacité de notre approche dans une étude pré-clinique chez la souris.

Les expériences seront réalisées avec la volonté de Réduire au maximum le nombre d’animaux par condition expérimentale tout en conservant un nombre suffisant de souris par lot pour pouvoir analyser nos résultats de façon statistique et ne pas avoir besoin de reconduire ce type de projet. Les accouplements seront contrôlés afin de générer que les animaux nécessaires pour le projet. Un total de 1200 animaux est prévu pour le projet.

Nos animaux seront hébergés dans une animalerie agréée avec un accès à l’eau et à la nourriture à volonté. Ils bénéficieront d’un enrichissement règlementaire. Le phénotype de notre modèle murin ne diffère pas du modèle sauvage durant le temps de l’expérimentation (12 mois maximum) permettant un hébergement en cage collective pour respecter leurs besoins sociaux. L’injection intraveineuse de notre thérapie génique est réalisée sous anesthésie générale avec un réveil post-anesthésie dans une cage chauffée, du gel ophtalmique est appliqué post-injection et mise en place d’une analgésie si besoin. Les prises de sang sont effectuées sous anesthésie générale avec réveil post-anesthésie dans une cage chauffée. L’organisation des tests comportementaux seront précédés d’une phase d’entrainement et une période de récupération d’au moins une demi-journée voire 1 jour entier est prévue afin de limiter au maximum le stress des animaux. Chaque animal sera surveillé de façon individuelle et de façon quotidienne. A chaque étape du projet, des points limites ont été établis et seront respectés pour soustraire l’animal à la souffrance.

Avec 98 pourcents d’identité protéique avec l’Homme, la souris constitue un modèle idéal pour reproduire les pathologies humaines afin de les étudier dans un contexte physiologique mais également de pouvoir tester et valider des approches thérapeutiques. L’étude de caractérisation du modèle utilisé dans ce projet a montré qu’il reproduit pour la première fois les désordres moteurs et sensoriels retrouvés chez les patients atteints de neuropathies à axones géants, justifiant son utilisation pour valider notre approche de thérapie génique. Les souris seront prélevées pour connaitre leur patrimoine génétique à l’âge de 7 à 10 jours. Notre projet utilisera le stade juvénile (1 mois) pour l’injection. En effet, les premiers symptômes se développant chez l’Homme à 2 ans, il est nécessaire de débuter la stratégie le plus tôt possible afin d’être le plus en amont possible afin de limiter au mieux les symptômes (1 mois) et de la poursuivre jusqu’au stade adulte (12 mois) pour valider notre protocole et évaluer ses bénéfices au niveau comportemental et histologique. Notre modèle murin présente des défauts moteurs et sensoriels (visibles uniquement au moment de tests comportementaux à partir de 3 mois). Un phénotype dommageable est développé par les souris à partir de 15 mois ce qui n’aura pas d’impact dans notre projet sachant que nos animaux seront maintenus jusqu’à 12 mois au maximum.