Détermination préliminaire de la toxicité et de la toxicocinétique de candidats médicaments chez la souris

L’objectif principal de la recherche et développement (R&D) est de développer de nouveaux candidats médicaments chimiques ou biologiques qui seront évaluées durant des essais cliniques en vue de satisfaire les besoins médicaux. des études préliminaires in vivo de sécurité non clinique sont mises en place sur des espèces rongeurs afin de déterminer un profil de sécurité robuste des nouvelles molécules avant administration chez l’Homme,. le développement d’un médicament nécessite d’évaluer à la fois : – la sécurité : par des études de toxicologie sur la souris (procédures encadrées par la présente DAP). – l’efficacité : à l’aide d’études de pharmacologie sur la souris (modèle mimant la pathologie) (procédures encadrées par d’autres DAP). Ces études in vivo de sécurité non clinique interviennent précocement dans le processus de développement pharmaceutique (en amont des études vivo d’efficacité) et ne sont réalisées que sur des molécules sélectionnées après des étapes de caractérisation/sélection in vitro (modèles cellulaires de toxicité) et in silico (ex. analyse informatique de la génotoxicité). A ce stade ni la dose efficace ni la première dose toxique in vivo ne sont connues. La réalisation de ces études chez la souris permet de déterminer un intervalle de doses tolérées par l’animal ainsi que la dose maximale à ne pas dépasser. Ces données sont essentielles pour que les études de pharmacologie, utilisant un effectif plus important de souris, puissent être réalisées dans des conditions optimales. Dans ce projet, des études de sécurité non clinique chez la souris seront réalisées afin de prédire la toxicité chez l’animal dans les études d’efficacité qui nécessiteraient d’utiliser de fortes doses et/ou des doses potentiellement toxiques (souvent le cas en oncologie). Elles permettent d’évaluer sur une courte durée et avec moins d’animaux si la dose et le schéma d’administration seront bien tolérés dans les études d’efficacité. L’utilisation de doses croissantes dans ces études peut permettre d’identifier la Dose Maximale Tolérée (DMT) pour un produit (ou un nouveau véhicule) et de l’utiliser en toute sécurité dans les études ultérieures. Ces études utilisent des souris ayant le même fond génétique (modèle non pathologique avec phénotype dommageable non exprimé) que les études d’efficacité afin qu’elles soient les plus prédictives possibles.

Ce projet s’inscrit dans le cadre de la recherche et développement de nouvelles entités à visée thérapeutique. Le bénéfice apporté par ce projet est l’optimisation du développement de candidats médicaments en évaluant très précocement leur toxicité éventuelle, en déterminant un profil de sécurité complet aux doses envisagées en efficacité et en ajustant au mieux les doses et le schéma expérimental. Cette approche permet ainsi de Réduire les contraintes auxquelles les animaux seraient soumis dans les études d’efficacité par la suite et qui, elles, utiliseront un nombre plus important d’animaux.

– A l’administration (unique à réitérée 1 à 3 fois par jour pendant 1 jour à 3 semaines) de composés par voie orale ou parentérale – A l’administration sous-cutanée d’analgésique avant l’euthanasie – A des prélèvements de sang grâce à la technique du microsampling (faible volume de sang prélevé à la veine marginale de la patte ou veine mandibulaire) : 6 prélèvements maximum sur 24 heures, 2 fois maximum dans l’étude – A des recueils urinaires d’une durée maximale de 4h heures sur sable hydrophobe (1 fois par étude au maximum) – A un prélèvement unique de sang en veine jugulaire réalisé sous anesthésie et analgésie avant l’euthanasie – A des examens paracliniques (ophtalmologie, nécessitant une contention légère au maximum 2 fois par étude

Dans le cadre de ce projet et pour une durée de procédure pouvant aller de 1 jour à 3 semaines, des nuisances ou douleurs peuvent survenir à savoir : – Conséquences directes des actes expérimentaux : •Administration orale de la molécule : la contention d’une durée de moins de 15sec et le passage de la sonde de gavage dans l’œsophage (moins de 10sec) peuvent générer du stress chez l’animal (maximum 3 fois par jour). (Degré de sévérité léger) •Administration intraveineuse : le passage dans une enceinte thermorégulée (nécessaire pour dilater les veines et réaliser le geste dans de bonnes conditions) d’une durée maximale de 5min, la contention dans une boite adaptée à l’espèce utilisée (2min maximum) peuvent générer du stress et l’injection de la douleur (maximum 2 fois par jour) (Degré de sévérité modéré). •Administrations intrapéritonéales, intramusculaires, intranasales ou sous-cutanées : la contention d’une durée maximale de 15s peut générer du stress et l’injection (moins de 10 sec) de la douleur (maximum 3 fois par jour). Degré de sévérité léger pour une ip unique ou modéré si l’administration ip est réitérée. Pour les autres types d’administrations degré léger. •Instillation oculaire (topique externe) : la contention d’une durée de moins de 15sec peut générer du stress et la molécule administrée de la douleur pour l’animal. (maximum 1 fois par jour) (Degré de sévérité léger) •Prélèvements de sang à la veine marginale de la patte, veine mandibulaire ou à la veine caudale : la contention d’une durée maximale de 2min ainsi que le prélèvement (moins de 30s) peuvent générer du stress et de la douleur (maximum 6 points de prélèvement sur 24h) (Degré de sévérité modéré) •Recueil urinaire (sable hydrophobe) : le changement d’environnement et l’isolement de courte durée (4 heures maximum) peuvent générer une nuisance et un stress pour l’animal (Degré de sévérité léger). – Conséquence indirecte des actes expérimentaux : La molécule administrée peut en elle-même induire des effets cliniques et provoquer une nuisance pour l’animal.

L’ensemble des animaux ayant reçu l’administration d’un candidat médicament dans ce projet sera euthanasié à l’issue de chaque procédure pour la collecte de sang/ liquide céphalo-rachidien pour analyse et d’organes pour lecture anatomopathologique. . Tous les animaux pour lesquels au moins un premier geste invasif a été réalisé dans le cadre de la procédure (entrant dans la définition de la procédure expérimentale réglementaire ex : micro-sampling) et qui n’ont pas reçu de candidat traitement /véhicule pourront être réutilisés dans un autre projet

Ce projet couvre les études de sécurité très précoces réalisées sur les candidats médicaments de notre recherche, études pour lesquelles il n’existe pas d’alternative, validée scientifiquement, éthiquement et réglementairement, à l’utilisation d’animaux. De méthodes alternatives in vitro et in silico sont utilisées au préalable dans la caractérisation et la sélection des molécules à tester dans ces études ce qui permet de Réduire fortement le nombre de molécules testées in vivo. Cependant, la mise en place précoce d’un profil de sécurité d’un candidat médicament nécessite l’utilisation d’organismes complexes après ces premières étapes de sélection par des méthodes alternatives. Les études incluses dans ce projet ont un design optimisé afin de n’utiliser que le strict minimum d’animaux et de générer des données essentielles pour les études ultérieures.

Les molécules les plus prometteuses sont sélectionnées à l’aide de tests vitro et ou silico avant la mise en place des études incluses dans ce projet. Le nombre d’animaux est adapté à la variabilité des paramètres étudiés et prend en compte l’homogénéité des souches, la disponibilité de données historiques pour les paramètres étudiés et de leur variabilité. Pour ces études, le nombre habituel d’animaux est déterminé pour être le compromis le plus efficace afin d’atteindre les objectifs des différentes procédures tout en utilisant le nombre d’animaux le plus restreint. Il permet d’intégrer de la mixité male/femelle dans les groupes sans avoir à doubler le nombre d’animaux. Exceptionnellement ce nombre peut être ponctuellement augmenté dans le cas où la variabilité d’un paramètre serait élevée (ex : haute variabilité individuelle dans la distribution du produit). Ces études permettent de confirmer les premières données in vitro, avant de réaliser les études vivo nécessaires à la poursuite du développement de la molécule. Elles participent à la Réduction du nombre total d’animaux utilisés par projet thérapeutique car les résultats obtenus sécurisent les études de pharmacologie utilisant un nombre d’animaux plus important en prédisant la toxicité éventuelle aux doses testées. Selon la procédure, un ensemble d’examens cliniques et paracliniques peuvent être réalisés par animal (observations cliniques, poids et température corporelle, examen ophtalmologique, prélèvement de sang pour pharmacocinétique ou biologie clinique, collecte d’urine, prélèvements d’organes…) réduisant aussi le nombre d’animaux nécessaire. Dans le cas d’un véhicule bien connu, les données historiques internes vont permettre de Réduire le nombre d’animaux dans l’étude en supprimant le groupe témoin véhicule). En cas de protocole particulier (ex : nouveau schéma d’administration ou besoin de suivre plus précisément un paramètre/biomarqueur particulier), le service de biostatistiques pourra aider à définir le design expérimental adapté. Enfin, l’utilisation de la technique du microsampling pour prélèvement de sang (prélèvement d’un faible volume à la veine marginale de la patte ou veine mandibulaire) peu invasive, rapide, permet de permet de Réduire le nombre d’animaux en réalisant une cinétique complète sur un même individu (sans animaux dédiés à la pharmacocinétique dans l’étude), tout en respectant les limites de volémie physiologiques et le bien-être animal.

Ces études permettent de mieux cibler les doses et le schéma d’administration pour les études suivantes, diminuant ainsi le risque pour les animaux. Des observations cliniques approfondies sont réalisées chaque jour. Les administrations pourront être réalisées de manière décalée : si un premier animal traité présentait des signes cliniques précoces (30 minutes après traitement par ex.), les autres animaux du groupe pourraient ne pas être traités ou leur dose administrée pourrait être diminuée. Dans tous les cas, si apparition de signes cliniques, une décision rapide est prise entre le vétérinaire, le responsable scientifique, la SBEA et les équipes en charge des animaux. Cette décision peut mener à une prescription de soins, un arrêt de traitement, une diminution de dose ou une euthanasie, tout en tenant compte de l’objectif de l’étude (si besoin utilisation du score d’une grille de points limites spécifique à la souris). L’ensemble des animaux est hébergé et manipulé dans un secteur à confinement spécifique avec des procédures d’accès, des conditions d’hébergement strictes empêchant ainsi l’expression du phénotype dommageable lorsque les animaux utilisés sont immunodéprimés. Les animaux sont manipulés par un personnel technique formé au bien-être animal afin de limiter le stress et peuvent être entrainés si l’étude nécessite un geste technique particulier (ex : contention pour administration intraveineuse. Tous les animaux sont stabulés en groupes, sauf cas exceptionnel (signes cliniques nécessitant l’isolement, recueil urinaire), avec de l’enrichissement adapté à la souris (matériel de nidification). Pour les prélèvements de sang, la technique du microsampling est mise en place dès que possible. Cette technique, rapide, peu invasive et peu stressante, permet de limiter l’impact d’une cinétique et de respecter les limites de volémie physiologiques. Elle permet d’éviter le placement de l’animal dans une enceinte thermorégulée pour la dilatation des vaisseaux. La durée du recueil urinaire sera limitée à son minimum (max 4h) et réalisé en cage conventionnelle en remplaçant la litière par du sable hydrophobe. Cela permet d’éviter l’usage de cage à métabolisme (environnement plus stressant). Dès qu’un acte expérimental nécessite une incision (ex: prélèvement de sang en veine jugulaire), une analgésie adaptée est mise en place en plus de l’anesthésie gazeuse.

L‘unique procédure de ce projet sera réalisée sur l’espèce souris car elle intervient en amont des études d’efficacité réalisées sur ce modèle. De plus cette espèce présente une forte homologie génétique et physiologique avec l’homme et ainsi une forte valeur translationnelle. La sélection se fait aussi sur des critères réglementaires, éthiques, scientifiques afin d’obtenir la meilleure prédiction possible de la réponse chez l’Homme. S’ajoutent à cela les données historiques (internes et issues de la littérature, par souche, âge, sexe) et nécessaires à l’évaluation et l’interprétation des effets ainsi que les données des études pharmacologiques réalisées en amont chez le rongeur. Pour se placer dans les mêmes conditions que les études d’efficacité puis les études requises ultérieurement, les souris utilisées seront des jeunes adultes et adultes, correspondant à l’âge des animaux utilisés communément dans les protocoles de recherche de candidat médicament et dans les études ultérieures à ce projet.