Résumé non technique d'un projet d'expérimentation animale, reproduit depuis ALURES
("EC NTS/RA identifier" : NTS-FR-595931)
Objectifs et bénéfices escomptés du projet
Décrire les objectifs du projet.
Les composés organophosphorés (OP) tels que les agents neurotoxiques de guerre (NOP) comme le sarin, ou certains produits phytosanitaires (pesticides) (OPP), constituent une menace actuelle pour les populations militaire et civile. Si des intoxications à fortes doses constituent toujours une menace (attaque terroriste), l’exposition de manière unique ou répétée à un agent neurotoxique à des doses asymptomatiques (terrains de guerre, épandage de pesticides…) est une réalité permanente. Les effets des doses plus faibles, peu symptomatiques voire asymptomatiques, sont peu étudiées. Pourtant, des troubles comportementaux persistants à très long-terme sont observés après une exposition unique à une dose asymptomatique d’OP chez l’animal. Mais des déficits cognitifs et neuropathiques ont également été observés chez des victimes humaines exposées à de faibles doses. En conséquence, il existe un besoin de biomarqueurs d’exposition permettant i) un diagnostic précoce présymptomatique et ii) l’évaluation et/ou le traitement des intoxications par des agents neurotoxiques sur une longue période. La barrière hémato-encéphalique (BHE) représente la principale surface d’échange entre la circulation sanguine et le tissu cérébral. L’atteinte de la BHE et son rôle sur la neurotoxicité suite à une intoxication aux OP reste mal connue. Des perturbations cérébrales suite à une exposition aux OP sont connus et peuvent avoir des effets importants sur la BHE. Il est donc très probable que son intégrité, sa capacité à transporter des molécules entre le sang et le tissu cérébral et son activation soient impactées. La BHE constitue une cible diagnostique intéressante et restaurer ses fonctions une stratégie thérapeutique potentielle originale. L’objectif du projet est d’étudier les propriétés d’intégrité, de transport et d’activation de BHE suite à une exposition aux agents neurotoxique et de les évaluer comme biomarqueur pour la détection et la prédiction des atteintes cérébrales. Cela permettra d’évaluer des stratégies thérapeutiques originales visant à tirer parti de l’atteinte de la BHE, i) soit en restaurant les propriétés physiologiques de la BHE en injectant différents médicaments, ii) soit en permettant le passage cérébral d’un antidote, grâce à la technologie des ultrasons focalisés (FUS). Cette technologie consiste à injecter dans le sang des microbulles gazeuses qui sous l’action locale et brève d’ultrasons focalisés rendent la BHE transitoirement perméable.
Quels sont les bénéfices susceptibles de découler de ce projet?
Ce projet permettra d’évaluer chez l’animal i) des biomarqueurs d’imagerie potentiels pour un diagnostic précoce pré-symptomatique et ii) un suivi thérapeutique ultérieur des intoxications par les agents neurotoxiques et les composés apparentés avec un potentiel de transférer ces biomarqueurs chez l’homme.
Nuisances prévues
À quelles procédures les animaux seront-ils soumis en règle générale?
Les interventions prévues sur les animaux sont listées ci-dessous : • Intoxication à un agent neurotoxique (ou solution contrôle) par injection (temps d’injection 10 secondes) suivi par une étude comportementale d’observation (durée 1 heure) pour déterminer les signes d’intoxication. L’injection et l’étude comportementale d’observation ne seront réalisées qu’une seule fois (tous les animaux). • Mise à jeun max 6h avant l’imagerie (seulement les animaux dont les radiotraceurs le demandent ) • Réalisation des tests comportementaux, les tests varient selon les points temporels de l’étude (durée 10 minutes maximum ; 2 à 4 tests max par animal) et des sessions d’imagerie à baseline puis différents temps post-intoxication (injection d’un radiotraceur durée 10 secondes) sous anesthésie gazeuse (durée 120 minutes au maximum ; tous les animaux) • Thérapie par injection de médicament (1 injection du médicament durée 10 secondes) sous anesthésie gazeuse (durée 5 minutes ; ) • Thérapie par ultrasons (ouverture de la BHE plus 1 injection de médicament) sous anesthésie gazeuse, durée 10 minutes ; 192 animaux). Perfusion terminale sous analgésie et anesthésie profonde.
Quels sont les effets/effets indésirables prévus sur les animaux et la durée de ces effets?
Les nuisances et effets indésirables Lors des expériences d’intoxication : • Les animaux peuvent être stressés lors des injections. De plus, l’injection de l’agent neurotoxique ou du traitement par le médicament antidotique peut induire une douleur (moins de 5 minutes). • Les animaux seront exposés à une dose sous-létale asymptomatique du de l’agent neurotoxique qui entraine une intoxication de faible sévérité. Ces effets apparaissent dans la première heure post-intoxication. Une surveillance jusqu’à 6 heures post-intoxication est mise en place pour assurer le bien-être des animaux intoxiqués. Lors des expériences d’imagerie : • Les animaux seront endormis lors des sessions d’imagerie (2h maximum) par voie gazeuse. Lors du réveil, les animaux peuvent être désorientées et stressées. • Une mise à jeun des animaux 6h avant l’imagerie TEP peut entrainer une perte de poids < à 5%. Lors des expériences ultrasonore (US) : • Une surdose ultrasonore peut entraîner un risque d’œdème cérébral local ou de pétéchie hémorragique. La technique des ultrasons focalisés est bien maitrisée au sein du laboratoire, le risque de surdose ultrasonore est donc très faible. • L’injection des microbulles et médicaments en intraveineux peut induire une courte douleur (moins de 5 min). • Les animaux seront rasés et épilés (par application d’une crème dépilatoire) sur la tête pour permettre la transmission des ultrasons. Cet acte peut causer une légère irritation cutanée, résultat d’une réaction inflammatoire limité à la zone de contact.
Justifier le sort prévu des animaux à l’issue de la procédure.
Tous les animaux seront euthanasiés à la fin de la procédure afin de prélever certains organes et d’étudier ex vivo certains paramètres et de les confronter aux données en imagerie.
Application de la règle des "3R"
1. Remplacement
Il n’existe actuellement aucune méthode alternative permettant d’étudier de manière intégrée la réponse du système nerveux central et périphérique à un agent neurotoxique. Par conséquent, l’étude des propriétés d’intégrité, de transport et d’activation de la barrière hémato-encéphalique (BHE) après une intoxication au NOP ne peut être réalisée qu’in vivo. En ce qui concerne l’ouverture de le BHE des études in vitro (sur fantôme et culture cellulaire) ont été réalisées pour affiner les paramètres ultrasonores, caractériser les agents ultrasonores utilisés pour ouvrir la BHE et limiter le nombre d’expériences in vivo en amont de ce projet. Cependant, l’ouverture de la BHE en tant qu’approche thérapeutique après intoxication d’un agent neurotoxique nécessite l’utilisation d’animaux vivants.
2. Réduction
L’utilisation de l’imagerie en longitudinal permettra de Réduire le nombre d’animaux. Un même animal passera plusieurs examens d’imagerie en absence ou présence d’un traitement ce qui réduit le nombre d’animaux. L’approche statistique envisagée devrait permettre la comparaison de quatre conditions expérimentales entre elles avec suffisamment de puissance pour mettre en évidence un phénomène pharmacocinétique notable localisé et dépendant du temps. L’expérience a montré que les tests comportementaux sont les données qui présentent la plus grande variance. Par conséquent, le calcul de puissance est effectué pour les tests de comportementaux. Nous souhaitons être capables de discriminer une taille d’effet de l’ordre de 25% alors même que l’écart-type attendu est lui aussi de l’ordre de 25%. Nos calculs nous amènent à considérer qu’un nombre de 480 animaux répartis en groupes de 24 est nécessaire pour obtenir des résultats statistiquement significatifs.
3. Raffinement
Une semaine d’acclimatation est prévue après accueil des animaux dans l’animalerie. Les animaux seront hébergés en groupe dans une cage avec accès sans restriction à la nourriture et à la boisson. Ils bénéficieront d’un milieu enrichi (matériel de nidification, tunnel, batônnets de bois). L’hébergement individuel des animaux sera limité au maximum afin de minimiser leur angoisse. Les animaux seront hebergés en individuel pendant la 1ère heure suivant l’intoxication afin de suivre l’évaluation de l’intensité de l’intoxication, puis remis en cage avec leurs congénères. Une surveillance journalière des souris pendant une semaine sera réalisée à la suite de l’intoxication notamment en se basant sur une grille d’évaluation préalablement établie Des points limites ont été déterminés en s’appuyant sur les scores de la grille d’évaluation. Tous les examens d’imagerie ou traitements thérapeutiques (ouverture BHE, injections de microbulles et/ou de médicaments) seront réalisés sous anesthésie générale par voie gazeuse afin de minimiser le stress de l’animal. L’animal sera maintenu sous un dispositif chauffant (tapis, lumière ou flux d’air) pour assurer son bien-être lors des manipulations. Certains radiotraceurs ou médicaments pourront également être administrés par voie intrapéritonéale, ce qui permet une injection rapide chez l’animal éveillé et réduit ainsi la nécessité d’une anesthésie. Lors des examens d’imagerie des larmes artificielles seront appliquées pour éviter le dessèchement de la cornée. Afin de minimiser le stress, la phase de réveil sera réalisée dans la cage de l’animal. L’étude comportementale sera réalisée avec des animaux vigiles mais sera conduite de manière la plus brève possible afin d’éviter tout stress supplémentaire aux animaux. Un suivi quotidien par les zootechniciens et les expérimentateurs sera pratiqué. En cas de complications, le vétérinaire de l’installation sera alerté afin de mettre en œuvre des traitements appropriés.
Expliquer le choix des espèces et les stades de développement y afférents.
Les expériences se feront sur la souris Swiss. Cette souche a permis la mise au point de récents modèles d’intoxication aux agents neurotoxiques. Les animaux utilisés sont des jeunes adultes âgés de 9 semaines au moment de l’intoxication, poids de 38-43g. Cet âge correspond aux précédents modèles développés et utilisés dans les laboratoires partenaires sur ce projet, mais il offre surtout la plus grande fenêtre de temps dans une population adulte pour mener des études sur les changements possibles (troubles cognitifs, caractéristiques de la BHE) à long terme et suite à un traitement. De plus, cette souche également utilisée dans notre laboratoire a permis la mise en évidence des désordres métaboliques sur le modèle d’exposition à un agent neurotoxique suivi par imagerie TEP. L’utilisation du même stade de développement nous permet ainsi de pouvoir comparer nos données et évaluer l’efficacité d’un nouveau traitement avec nos résultats précédents et ceux obtenus par les autres partenaires.