Mise en place des vaisseaux sanguins et de l’hématopoïèse chez la souris au cours du développement embryonnaire et chez l’adulte

Le projet consiste à étudier l’origine et la mise en place du système sanguin (vaisseaux et sang), et en particulier des cellules souches hématopoïétiques (CSH), au cours du développement embryonnaire, foetal, ainsi que son déploiement dans la moelle osseuse après la naissance. Cette approche nécessite l’utilisation de 2 types de souris transgéniques capables de marquer (par une protéine fluorescente) de façon indélébile certaines cellules embryonnaires cibles qui sont à l’origine des cellules des vaisseaux sanguins de l’embryon et suivre leur devenir. L’ensemble des connaissances acquises au cours de cette étude visent à mieux comprendre l’origine et la génération des CSH à partir des cellules des vaisseaux sanguins dérivés de cellules embryonnaires. Cette étude permettra de dégager des mécanismes de production des CSH et de les transposer à des systèmes de culture in vitro à des fins thérapeutiques.

Il est critique de bien comprendre comment les cellules souches hématopoïétiques se forment au cours du développement normal. En effet, ces cellules sont d’une très grande importance en clinique car elles sont utilisées pour transplanter des patients atteints de maladie du sang. Bien connaitre leur mode de formation nous permettra de manipuler ces cellules à façon, par exemple de les générer en culture a des fins de transplantations. Dans cette étude nous voulons démontrer que certaines cellules endothéliales issues de cellules mésodermiques sont capables de générer des cellules souches hématopoïétiques sous certaines conditions (selon leur origine, leur localisation [foie foetal, moelle osseuse…]). Déterminer quels sont ces facteurs (origine cellulaire, contact avec d’autres cellules au cours du développement et en condition homéostatique) et caractériser (au niveau moléculaire) les étapes de formations des cellules souches hématopoïétiques nous permettra de manipuler cesdernières à des fins cliniques.

Une partie des souris subiront une injection par voie intra-péritonéale 2 fois à 24h d’intervalle, les animaux seront vigiles au moment de l’injection, la contention et l’injection durent moins d’une minute. Ils seront ensuite euthanasiés aux différents stades requis pour le projet. Une autre partie sera anesthésiée pour effectuer un prélèvement de sang avant d’être euthanasiée. L’endormissement dure environ 20 minutes, le prélèvement sanguin 30 secondes.

Pour induire la recombinaison, les souris gestantes recevront à un stade précis une injection intrapéritonéale entrainant un stress lors de la contention et une douleur légère de courte durée au moment de l’introduction de l’aiguille. Le produit peut entrainer une difficulté de mise bas, ce qui peut entrainer une douleur à la femelle. Dans certains cas, nous serons amenés à faire des prélèvements sanguins (uniquement chez le jeune adulte/adulte) sous anesthésie générale avant euthanasie. Cette anesthésie peut induire un léger stress et dans de rare cas peut provoquer un arrêt cardio-respiratoire

Les femelles gestantes seront euthanasiées aux stades définis par le protocole expérimental afin d’analyser les embryons par des expériences immunohistologiques et de cytométrie en flux. Les souris ayant subi un prélèvement sanguin, seront euthanasiées afin de récupérer les organes hématopoïétiques (fémur, rate et thymus) pour analyse.

A l’heure actuelle, il n’existe aucun système de Remplacement (autre que le modèle murin) permettant de suivre comment certaines cellules de l’embryon s’organisent pour former un organe ou un système biologique chez l’adulte. Pour notre étude, il nous est nécessaire d’utiliser des souris modifiées génétiquement afin de suivre le devenir de cellules spécifiques depuis le développement de l’embryon jusqu’au stade adulte pour comprendre en détail comment les vaisseaux sanguins et le sang se mettent en place

Pour cette étude nous utiliserons 440 animaux. Nous utilisons des animaux transgéniques homozygotes ce qui nous permet de nous assurer que tous les embryons de la portée ont le même génotype et peuvent donc tous être analysés, ce qui réduit le nombre de femelles gestantes à induire. Le nombre de souris utilisées a été calculé au mieux pour limiter au maximum le nombre d’animaux tout en permettant d’avoir des analyses statistiquement correctes. Pour cela nous utiliserons des tests quantitatifs de comparaison de 2 échantillons indépendants.

Les souris sont placées dans des cages adaptées à leur nombre, ces cages seront enrichies par du matériel de nidification (sizzle-dri kraft). La nourriture et l’eau de boisson sont fournis ad libidum. Les cages des mâles isolés servant aux accouplements contrôlés seront enrichies en buchettes en bois. Les femelles gestantes qui auront été injectées seront observées quotidiennement selon l’évaluation des expressions faciales. Les souris pour lesquelles nous souhaitons une mise bas seront surveillées 2 fois par jour à l’approche du terme, si elle s’avère trop difficile la mère sera euthanasiée et les embryons collectés. Les prélèvements sanguins seront effectués sous anesthésie générale (comportant une valence analgésique) avant euthanasie. Le projet comportera la mise en place de points limites définis.

A l’heure actuelle, il n’existe aucun système de Remplacement (autre que le modèle murin) permettant de suivre comment certaines cellules de l’embryon s’organisent pour former un organe ou un système biologique chez l’adulte. Pour notre étude, il nous est nécessaire d’utiliser des souris modifiées génétiquement afin de suivre le devenir de cellules spécifiques depuis le développement de l’embryon jusqu’au stade adulte pour comprendre en détail comment les vaisseaux sanguins et le sang se mettent en place. Pour cela des femelles gestantes seront utilisées pour collecter les embryons à différents stades de développement, ce qui nous permettra d’étudier la mise en place des vaisseaux sanguins et du sang au cours du temps. Des souris jeunes adultes (6 semaines) et adultes (4mois) seront également analysées pour vérifier comment les cellules se maintiennent au cours du temps ou s’il y a un remodelage post-natal