Résumé non technique d'un projet d'expérimentation animale, reproduit depuis ALURES
("EC NTS/RA identifier" : NTS-FR-619193)
Objectifs et bénéfices escomptés du projet
Décrire les objectifs du projet.
Afin d’envisager de nouvelles thérapies pour lutter contre l’obésité et ses comorbidités, il est nécessaire de mieux connaître les phénomènes biologiques qui régulent la prise alimentaire et le poids corporel. Une région du cerveau appelé hypothalamus regroupe des neurones sensibles aux signaux des autres organes du corps, les renseignant sur l’état énergétique de l’organisme. La consommation d’un régime hypercalorique riche en graisses (High fat diet, HFD) entraîne une inflammation de l’hypothalamus. On sait que les microglies, qui sont les cellules immunitaires du cerveau (qui protègent le cerveau des attaques extérieures), sont aussi impliquées dans la régulation du poids corporel. En effet, elles participent à l’inflammation hypothalamique suite à la consommation d’un régime HFD. Leur activation est variable en fonction de la période d’exposition au régime HFD (entre les premiers jours et plusieurs semaines). On sait que limiter l’activation des microglies en réponse au HFD limite l’inflammation. Cependant, les mécanismes moléculaires impliqués dans ces cellules restent mal connus. Nous faisons l’hypothèse que certaines molécules microgliales, qui sont impliquée dans les fonctions inflammatoires, participent aussi à la régulation de la prise de poids. Dans ce projet, nous souhaitons présicer le rôle des microglies dans le développement de l’inflammation hypothalamique en réponse à un régime hypercalorique afin de mieux les contenir et ainsi de prévenir la prise de poids. Notre ambition à terme est de permettre l’ouverture de nouvelles pistes thérapeutiques pour les patients atteints d’obésité. Pour cette étude, nous allons utiliser des approches pharmacologiques et génétiques (utilisation d’animaux transgéniques). Nous utiliserons un modèle animal d’obésité, c’est-à-dire des animaux nourris avec une alimentation hypercalorique obésogène. Nous réaliserons un suivi métabolique chronique des animaux (prise alimentaire, tests métaboliques), ainsi que de nombreuses études moléculaires à partir des cellules cérébrales isolées. Ce projet comprend six procédures.
Quels sont les bénéfices susceptibles de découler de ce projet?
Les informations tirées de la réalisation de ce projet permettront de mieux comprendre le rôle de la microglie dans le développement de l’obésité et les dérèglements métaboliques en réponse à un régime riche en calories, ainsi que les changements inflammatoires sous-jacents dans le cerveau. Dans une perspective thérapeutique à plus long terme, ces données seront utiles pour des tentatives de modulation de la microglie afin de contrer les troubles métaboliques, dans le cas où nos résultats supporteraient cette hypothèse.
Nuisances prévues
À quelles procédures les animaux seront-ils soumis en règle générale?
Voici la liste des principaux gestes techniques réalisés sur les animaux. 1) Analyse de la composition corporelle : cette analyse nécessite que la souris vigile soit maintenue en contention, pour une durée maximale de 5 minutes, sans anesthésie. Les souris subiront 1 à 4 analyses de ce type au cours de ce projet, espacées au minimum de 3 semaines (1536 animaux). 2) Neuro-chirurgie : cette technique permettra soit de mettre en place un implant permettant d’injecter des traitements pharmacologiques, soit un virus qui permettra un changement génétique des microglies. Elle est réalisée sous anesthésie générale. Une seule neuro-chirurgie sera effectuée dans la vie de l’animal (384 animaux). Une partie des 384 animaux subiront une seconde chirurgie de courte durée (10 minutes, 128 animaux) pour le Remplacement d’un implant sous-cutané. 3) test de tolérance au glucose : ce test nécessite de réaliser, après un jeûne de 5 heures, une injection de gluocose dans l’abdomen des souris, puis de mesurer leur glycémie à différents temps post-injection. Les 5 mesures de glycémie sont espacées d’au moins 15 minutes chacune. Ce test est réalisé sur souris vigiles. Un seul test sera réalisé durant toute l’étude (752 animaux). 4) tests de calorimétrie indirecte (496 animaux concernés au maximum) : ces cages spéciales permettent d’enregistrer en temps réel la consommation de nourriture, d’eau, d’oxygène et la dépense énergétique. Elles nécessitent d’isoler l’animal en cage individuelle (pendant deux semaines), qui sont enrichies avec un nid de coton et un bâtonnet de bois à ronger.
Quels sont les effets/effets indésirables prévus sur les animaux et la durée de ces effets?
Dans notre étude, les animaux seront parfois isolés à l’âge adulte (suite à une chirurgie ou lors des sessions de cages métaboliques). Cet isolement est nécessaire pour quantifier la consommation de nourriture de chaque animal ou limiter la dégradation des implants. Au-delà du stress d’isolement social, ces animaux subiront un stress de contention lors de l’analyse de composition corporelle, qui se déroule dans un tube en plastique au fond duquel les souris sont bloquées. Ce stress est cependant d’une durée limitée, l’analyse ne prenant que 5 minutes au maximum. Les souris seront aussi maintenues en contention dans leur tunnel en carton carton avec la queue qui dépasse, pendant 5 secondes, pour réaliser des prélèvements sanguins au bout de la queue (zone peu innervée). Le poids des animaux pourra varier en fonction du régime alimentaire donné (+200% sur le long terme en réponse à un régime hypercalorique) ou des restrictions alimentaires (-10% maximum du poids du jour précédent lors d’une mise à jeun). Les nuisances les plus importantes sont attendues lors de la neuro-chirurgie. L’incision de la peau du crâne, l’hypoxie relative et la déshydration induite par l’anesthésie peuvent provoquer des douleurs post-opératoires.
Justifier le sort prévu des animaux à l’issue de la procédure.
À l’issue de toutes les procédures, tous les animaux seront mis à mort pour récupérer des tissus, afin de réaliser des analyses in vitro supplémentaires, qui nous apporteront des informations cruciales sur les conqéquences des changements moléculaires microgliaux.
Application de la règle des "3R"
1. Remplacement
Le but de ce projet est de comprendre le rôle de la microglie hypothalamique sur un ensemble de variables métaboliques intégrées, telles que le poids, la composition corporelle et la régulation de la glycémie. Dans ce contexte, la région cérébrale que nous étudions n’est pas isolée, et interagit avec d’autres structures du cerveau mais également avec des organes périphériques (foie, pancréas, tissu adipeux…). Les effets que nous étudions sont donc la résultante de cette communication entre divers réseaux de neurones et la périphérie. Des interactions aussi complexes ne peuvent être modélisées in vitro, et certains des effets étudiés comme le comportement alimentaire nécessitent un animal vivant. De même, il n’existe aucun modèle informatique qui pourrait Remplacer l’animal dans le cadre de cette étude. A noter, ce projet a d’abord fait l’objet d’études réalisées in vitro (cultures cellulaires) afin de mieux cibler les voies de signalisation impliquées dans notre hypothèse. De plus, les modèles génétiques nécessaires pour répondre à notre question scientifique ont été développés chez la souris.
2. Réduction
Nous avons utilisé un test de puissance statistique pour déterminer le nombre minimum d’animaux nécessaire pour obtenir des résultats exploitables statistiquement. Afin de Réduire le nombre d’animaux utilisés, nous avons regroupé dans la mesure du possible nos différents tests métaboliques sur les mêmes animaux, de manière à obtenir un maximum d’information à partir des mêmes animaux. En particulier, l’analyse de la composition corporelle (masse grasse vs masse maigre) est réalisée dans un appareil spécifique qui ne nécessite pas la mise à mort des animaux. Cela nous permet ainsi de réaliser plusieurs mesures à des temps différents sur les mêmes animaux, au lieu d’avoir recours à des lots différents.
3. Raffinement
Nous avons défini différents points de Raffinement tout au long de l’étude : 1) Les animaux arriveront dans la pièce d’hébergement à l’âge de 3 ou 7 semaines et seront habitués pendant 1 semaine. Cette période d’habituation permettra de diminuer le stress des animaux en réponse à l’expérimentateur. Toutes les expériences seront réalisées par du personnel formé et entraîné. 2) L’évaluation de la prise alimentaire nécessite parfois la répartition des animaux en cages individuelles. Pour compenser le manque d’interactions sociales, les cages, transparentes et enrichies, seront rapprochées au maximum les unes des autres. 3) L’enrichissement des cages se compose de carrés de cellulose pour nidifier, un tunnel en carton pour se cacher et de bâtonnets en bois pour ronger. 4) Environnement sonore : Une radio est installée dans la pièce d’hébergement afin d’atténuer l’impact des bruits extérieurs qui pourraient se produire accidentellement. 5) Notre étude nécessite une chirurgie stéréotaxique, qui sera réalisée sous anesthésie générale. La prise en charge de la douleur est assurée par un protocole associant morphinique, anesthésique local et traitement anti-inflammatoire. Durant la chirurgie, dès l’induction, les souris seront maintenues sur tapis chauffant et leur réveil s’effectuera en couveuse, pour prévenir le risque d’hypothermie. Leurs yeux seront également protégés de la sécheresse oculaire par application d’un gel ophtalmique. Enfin, le traitement anti-inflammatoire se poursuivra dans les 2 jours suivant la chirurgie, avec un suivi renforcé des souris durant cette période pour s’assurer de leur récupération. 6) Des points limites précoces et terminaux appropriés ont été définis : ces critères prennent en compte l’apparence, l’évolution du poids, le comportement, les signes cliniques (température et respiration) et l’aspect de la plaie (le cas échant). Des mesures conservatoires sont prévues pour chaque critère, afin de prendre en charge promptement toute modification de l’état de l’animal. Lorsqu’un point limite précoce est atteint, nous demanderons un avis vétérinaire afin d’envisager la mise en place de soins personnalisés compatibles avec le maintien de l’animal dans l’étude. En cas d’échec ou si un point limite terminal est atteint, l’animal sera retiré de l’étude et mis à mort, pour lui éviter toute souffrance que nous ne pourrions soulager.
Expliquer le choix des espèces et les stades de développement y afférents.
La régulation du poids corporel, le comportement alimentaire et le métabolisme glucidique sont depuis longtemps étudiés chez la souris, qui représente donc une espèce adaptée à ce type d’études. De très nombreux modèles d’obésités ont été développés chez la souris. De nombreux modèles génétiquement modifiés existent et permettent l’étude de mécanismes moléculaires précis. De plus, la souris est une espèce de prédilection pour la création d’animaux transgéniques, d’autant que son cycle de reproduction court permet d’avoir un nombre suffisant d’animaux rapidement. Enfin, la forte proximité biologique entre l’homme et la souris en ce qui concerne le contrôle de la prise alimentaire fait de la souris un bon modèle prédictif. En particulier, dans le cadre de cette étude, l’inflammation hypothalamique et la réactivité microgliale induite par un régime obésogène est retrouvé à la fois chez la souris et chez l’Homme. Toutes les souris de cette étude seront adultes, elles arriveront entre 3 et 7 semaines d’âge dans notre animalerie, mais nous ne commencerons les expériences qu’à partir de l’âge de 8 semaines. Cet âge est celui auquel on estime que le crâne a fini sa croissance, ce qui nous permet d’utiliser des atlas de référence pour la réalisation de la neuro-chirurgie.