Effet de la survenue d’hémorragies cérébrales dans un contexte de troubles de l’hémostase chez la souris

Notre projet repose sur l’utilisation d’un modèle pré-clinique d’hémorragie intracérébrale (HIC) chez le rongeur, caractérisée par un saignement occasionné par la rupture de vaisseaux cérébraux. Cet accident vasculaire cérébral est l’un des plus dévastateurs, avec en 2018 un taux de mortalité de 50% la première année. Environ 30% des survivants deviennent dépendants 4 ans plus tard. Il n’y a actuellement pas de traitement. Des recherches précliniques et cliniques sont en cours. Mais dans les essais cliniques, les personnes atteintes d’anomalies de l’hémostase (hémophilie, maladie de Von Willebrand…) sont exclues d’emblée, du fait de risque accru de saignement. Ce modèle a été validé chez le rat (projet APAFIS numéro #14066-2018031312529642v3) mais nécessite d’être validé chez la souris pour pouvoir bénéficier de modèles hémophiles dans cette espèce. Le but de ce projet est d’évaluer dans quelle mesure les troubles hémostatiques influencent la taille et les mécanismes inhérents à la survenue d’une HIC. de microhémorragies cérébrales (MHC) disséminées dans tout le cerveau du rongeur, modèle se rapprochant ainsi des cas cliniques retrouvées dans certaines maladies neurodégénératives. Ce modèle repose sur l’utilisation de cyclodextrines (CD) qui, à forte dose, ouvrent les barrières biologiques comme la barrière hématoencéphalique (BHE), en « érodant » les membranes cellulaires endothéliales jusqu’à obtenir des MHC disséminées. Ce modèle a été validé chez la souris (APAFIS n°19866-2019030701722644). Les MHC sont des constructions radiologiques qui se présentent sous la forme de foyers hypointense visibles et qui sont prédicteurs d’une future hémorragie intracérébrale (HIC), le type d’Accident Vasculaire Cérébral (AVC) le plus dévastateur sans traitement validé à ce jour. Le but de ce projet est d’évaluer dans quelles mesures les troubles hémostatiques influencent l’incidence des MHC et leur transformation en HIC. L’existence d’un trouble hémostatique favorise-t-il la transformation en macro-saignement? Par quels mécanismes? Les anomalies hémostatiques congénitales telles que l’hémophilie et la maladie de von Willebrand sont des situations uniques, dans lesquelles l’HIC est fréquente et dévastatrice. Grâce à l’utilsation de lignées murines d’hémophilie et de maladie de Von Villebrand, nous explorerons la transformation potentielle des MHC en HIC et étudierons le rôle de ces défauts hémostatiques sur la réponse inflammatoire autour du saignement.

Ce projet permettra de mieux comprendre l’influence de troubles de l’hémostase (défaut de coagulation ou de l’hémostase primaire) sur la taille des HIC, ainsi que les mécanismes impliqués dans leur évolution, notamment sur la réponse inflammatoire autour du saignement. sur la fréquence et la taille des MHC, ainsi que les mécanismes impliqués dans leur transformation en HIC, notamment sur la réponse inflammatoire autour du saignement. L’identification des facteurs prédictifs d’une future hémorragie cérébrale est de la plus haute importance chez les personnes atteintes de graves déficiences hémostatiques et peut conduire à une modification du régime de traitement préventif des patients, et peut aussi, en cas d’HIC, leur permettre de bénéficier de traitements innovants pour lesquels ils sont actuellement exclus par principe de précaution. A partir d’un scénario plutôt caricatural d’une maladie génétique rare, ces nouvelles connaissances peuvent également profiter à tous les patients présentant d’autres anomalies hémostatiques (par exemple les personnes traitées par anticoagulants oraux).

Tous les animaux subiront la chirurgie permettant d’induire les HIC (environ 30 min par intervention), ainsi qu’une IRM à 4h et à 7j de l’injection (chaque IRM dure 30 min).

L’induction des HIC MHC chez les animaux se fait par une chirurgie réalisée sous anesthésie. Malgré nos précautions, il se peut que que cela entraine une gêne chez l’animal à plus ou moins long terme (perte d’appétit, de motivation, augmentation de l’anxiété). De même, les animaux subiront une IRM nécessitant une anesthésie non invasive sous isoflurane pouvant entrainer un stress et un mal-être chez l’animal mais qui reste proche de l’induction et dont les effets sont minimes et à court terme. La mise en place d’une surveillance rapprochée et de points limites permettra de limiter au maximum ces gènes potentielles.

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure. Le cerveau sera ensuite prélevé dans le but de réaliser des études histologiques et immunohistochimiques.

L’expérimentation proposée vise à comprendre les mécanismes impliqés dans la survenue de MHC dans un contexte de troubles hémostatiques Il s’agit de l’étude d’un modèle physiopathologique intégré faisant appel à de nombreux types cellulaires et à de nombreux mécanismes donc la complexité et la cinétique ne peuvent être reproduites in vitro.

L’ensemble des procédures expérimentales nécessaires à l’accomplissement de ces études requiert un nombre total de 450 animaux. Le nombre minimal nécessaire d’animaux a été défini pour assurer la validité scientifique et statistique des résultats (différences statistiquement observables entre les animaux traités et les animaux contrôles). Les données et les analyses statistiques sont conformes aux recommandations sur la conception expérimentale et l’analyse en pharmacologie.

Dans tous les cas, l’ensemble des procédures expérimentales sera réalisé en limitant au maximum (durée et intensité) toute douleur et/ou stress pour les animaux. Les animaux seront surveillés quotidiennement et une vigilance particulière sera réalisée sur les points limites afin de respecter au mieux le bien-être animal. Selon les critères observés et la cause identifiée, les animaux seront soit isolés et soignés, et/ou recevront un traitement analgésique, ou seront mis à mort dans une salle dédiée. La structure BEA (Bien-Etre Animal) ou le vétérinaire référent seront sollicités pour avis si besoin. Les conditions d’hébergement sont optimisées avec un environnement contrôlé (température, pression, humidité de l’air) et de l’enrichissement dans les cages.

Le retentissement des conséquences neurologiques induites par cette ces procédures varie en fonction des espèces choisies. En accord avec ces données de la littérature et surtout afin de stabiliser la reproductibilité des lésions cérébrales contribuant à terme à Réduire le nombre d’animaux opérés, nous avons choisi des souris C57bl6 homozygotes stables. Le choix de cette espèce de rongeurs repose sur les recommandations STAIR et est adapté à l’évaluation expérimentale. Nous utiliserons des souris âgées de 3 à 4 mois, âge nécessaire pour permettre la mise en place des troubles hémostatiques.