Essai d’une thérapie tissulaire complexe pour le remplacement de photorécepteurs chez le rat

Les rétinites pigmentaires (RP) entrainent des pertes sévères et rapides de la vision pouvant conduire jusqu’à la cécité et affectent des millions de personnes dans le monde. Les RP sont d’origine monogénique et affectent environ 200.000 personnes en France. Jusqu’à présent aucun traitement n’est disponible dans la plupart des cas. Ce projet a pour objectif de vérifier que l’on peut rétablir la vue avec la transplantation d’un morceau de rétine fabriqué en laboratoire. Ce morceau de rétine est fabriqué en laboratoire à partir de cellules souches humaines. Les transplantations sont réalisées dans un modèle de rats porteur d’une mutation génétique entrainant la perte de la vue et également d’une mutation qui altère le système immunitaire (pour éviter les mécanismes de rejet du greffon). Le potentiel thérapeutique des greffons est évalué par des approches comportementales et électrophysiologiques (sensibilité de la rétine à la lumière). Par ailleurs, lors de la greffe, nous évaluerons également si des vésicules extracellulaires (petites subtances produites par des cellules) peuvent facilité la prise des greffes dans la rétine.

Il n’existe peu ou pas de traitement pour soigner les rétinites pigmentaires ou pour restaurer la vision quand celle-ci est perdue. L ‘objectif est de développer des approches de thérapie cellulaire à base de morceaux de rétine obtenus à partir de cellules souches humaines. Cette thérapie aura pour objectif de restaurer la vision dans ces maladies.

Une procédure chirurgicale sous anesthésie générale sera réalisée chez les rats. De plus, la chirurgie sera réalisée sous analgésie en complément de l’anesthésie. Cette procédure chirurgicale consiste en la transplantation intraoculaire (sous la rétine) d’un tissus rétinien fabriqué en laboratoire. Cette opération dure 15 à 20 minutes. Cette opération n’est réalisée qu’une seule fois. Pour ces études une lignée de rats modélisant la rétinite pigmentaire et avec une immunodéficience (pour éviter les rejets de greffe) sera greffée avec les cellules. Les rats ont un phénotype dommageable : ils sont plus susceptibles de développer des infections opportunistes du fait de leur statut immunodeficient. Tous les animaux feront l’objet d’un examen par imagerie permettant l’observation de l’anatomie et la structure de la rétine (tomographie par cohérence optique) et d’un examen électrophysiologique (Electrorétinogramme) qui permettent l’étude de la fonction de ce tissu; ces examens qui nécessitent l’immobilité de l’animal se fera sous anesthésie générale ; Les examens d’imagerie ont une durée de 10 à 15 minutes; l’électrorétinogramme a une durée de 30 minutes environ. Ces examens seront réalisés une fois par mois (maximum de 7 fois pour les animaux gardés le plus longtemps) Les animaux réaliseront également des tests comportementaux à l’état vigil sans contrainte particulière (maximum de 7 fois pour les animaux gardés le plus longtemps). ces tests de la fonction visuelle sont rapides (5 à 10 minutes environ). Ces examens seront réalisés une fois par mois. Aucun prélèvement ne sera réalisé sur les animaux vivants. Anesthésies (injections intrapéritonéales d’une durée de quelques secondes): 15 fois par animal au cours de l’étude qui dure jusqu’à 6 mois. Analgésies + antidote anesthésie (injections sous cutanées d’une durée de quelques secondes): 18 fois par animal au cours de l’étude qui dure jusqu’à 6 mois. Les rats seront euthanasiés à la fin de l’étude par une méthode réglementaire en vue d’une analyse histologique de l’œil.

Les injections sous-rétiniennes/greffes peuvent provoquer des lésions temporaires comme des décollements localisés de la rétine et de petites hémorragies oculaires. Un léger stress peut être engendré lors du changement d’environnement des animaux (mise en chambre noire la veille de l’electroretinogramme). Un stress peut aussi être engendré lors des contentions réalisées pour les injections intraperitoneales et sous cutannées. Le phénotype immunodéprimé entraine une perte de poils à 3 ou 4 semaines avec une réapparition par touffes au cours de la vie du rongeur. Ces poils peuvent s’accumuler dans l’oeil sous les paupières et cela nécessite donc un soin particulier pour éliminer cette accumulation. Les animaux sont plus susceptibles de développer des infections opportunistes du fait de leur statut immunodeficient.

A la fin de chacune des procédures, les animaux sont euthanasiés par une méthode réglementaire pour permettre des analyses histologiques ou fonctionnelles (électrophysiologiques) des tissus (rétine). Ces explorations sont nécessaires pour évaluer le bénéfice de la transplantation au cœur du projet et le devenir des cellules transplantées (intégration au tissus de l’hôte, etc…).

Le projet consiste à évaluer la capacité d’une greffe de cellules à permettre une préservation de la fonction visuelle. Cette évaluation ne peut donc pas être faite par des approches in vitro. Les approches in vitro ne permettent d’évaluer que des paramètres isolés de culture et non des interactions avec une rétine. Il n’est ainsi pas possible de démontrer la fonctionnalité d’un produit de thérapie cellulaire de la rétine autrement que in vivo. Ce projet ne peut être réalisé que chez l’animal.

Afin de Réduire au maximum le nombre d’animaux, les transplantations seront réalisées dans un seul œil ; l’œil controlatéral servira de contrôle évitant d’utiliser d’autres animaux dans ce but. Par ailleurs, la majorité des actes peuvent être réalisés sur les mêmes animaux permettant ainsi de Réduire le nombre d’animaux utilisés. Nous avons réduit le nombre d’animaux par groupe au minimum requis pour obtenir des résultats statistiquement interprétables en tenant compte de la variabilité plus importantes des mesures effectuées (en raison d’un taux d’échec évalué à 20-30 pour cent (chirurgie, rejet de greffe, opacification du cristallin, etc..). Le nombre a été calculé sur la base des données de la littérature pour des approches similaires et en fonction du devenir post-mortem des animaux. Pour limiter le nombre d’animaux, Les résultats seront analysés à l’aide de tests statistiques non-paramétriques adaptés aux petits effectifs. Au final, 220 animaux seront utilisés dans le projet.

Les animaux seront examinés quotidiennement par les expérimentateurs et le personnel qualifié de l’animalerie et seront hébergés dans les conditions conformes à la réglementation (cages de stabulation avec enrichissement (bâtons à ronger, lambeaux de papier kraft), nourriture et boisson à volonté). Dans ce modèle de rat, le phénotype immunodéprimé entraine une perte de poils à 3 ou 4 semaines avec une réapparition par touffes au cours de la vie du rongeur. Ces poils peuvent s’accumuler dans l’oeil sous les paupières et cela nécessite donc un soin particulier pour éliminer cette accumulation. Le phénotype aveugle ne gêne pas l’accès à l’eau et à la nourriture qui sont facilement accessibles et à volonté dans la cage. Les rats bénéficieront d’une anesthésie générale fixe. Pour les injections intraoculaires, une anesthésie préalable de la cornée sera réalisée. Le risque de douleur généré par la transplantation de tissus est géré en pré- et post-opératoire par l’injection d’analgésiques. Les animaux feront l’objet d’une surveillance plus accrue pendant les 24 heures suivant les différents actes (réveil post-anesthésie, état de la surface oculaire après les électrorétinogrammes, signe d’inflammation, etc…). Tout signe d’inflammation ou d’infection de l’oeil entraînera l’euthanasie.

Les rats sont couramment utilisés dans les études précliniques. La taille de l’animal rend le geste technique (transplantation sous-rétinienne) moins difficile que chez la souris par exemple, ce qui réduira significativement le risque d’échec de la procédure et donc le nombre d’animaux nécessaire à l’étude. Rats modèlisant la rétinite pigmentaire et immunodéficient : Ces rats portent une mutation spontanée qui conduit à la perte rapide de la vue et une autre mutation qui affaibli le système immunitaire (pour prévenir le rejet de greffe). Comme la perte des cellules de la rétine débute dès 3 semaines après la naissance, les rats seront injectés à 3 semaines avec des vésicules extracellulaires (produites par des cellules) pour tester leur potentiel fonctionnel à moduler l’environnement dégénératif. Pour greffer un morceau de rétine issu de cellules souches, les rats seront greffés à un stade ou la vue est complétement perdue (vers 2/3mois après la naissance). Les différentes analyses seront réalisées dès 30 jours après l’opération. L’ensembles des autres actes des différentes procédures seront réalisées au plus tôt un mois après la transplantation et jusqu’à 6 mois post-greffe, le stade le plus tardif prévu par l’étude.