Modèle de Maladie de Parkinson chez la Souris : approche thérapeutique par transfert de gène dans un modèle de souris inoculée par des fibrilles d’alpha-synucléine.

Notre objectif est d’évaluer l’effet thérapeutique d’un vecteur viral de type adénovirus (AAV) dans le cadre d’un projet de thérapie génique ciblant la maladie de Parkinson, en utilisant un modèle de souris âgées de plus de 12 mois atteintes de la maladie de Parkinson. Les vecteurs virus adéno-associé recombinants (rAAV) ont récemment montré des résultats encourageants pour le traitement de maladies génétiques. La thérapie génique par vecteurs AAV est en plein développement dans plusieurs maladies humaines, notamment dans certaines affections neurologiques. La maladie de Parkinson est une maladie neurodégénérative sévère caractérisée par la mort d’un certain type de neurones (dopaminergiques) et dont la fréquence augmente chez des personnes de plus de 60 ans. Cette affection provoque des difficultés motrices importantes voire invalidantes. Même s’il existe des traitements qui peuvent améliorer les symptômes, il n’existe pas à ce jour de traitement curatif de la pathologie. L’accumulation dans certains neurones d’agrégats de protéines composés d’alpha-synucléine est un mécanisme central de la maladie humaine qui conduit à la mort des neurones. Pour mettre au point une thérapie génique innovante, notre objectif est de créer un modèle d’étude de la maladie pertinent, pour cela nous utiliserons le modèle souris, dans lequel nous inoculerons des agrégats (fibrilles) d’alpha-synucléine dans le cerveau. Deux études ont déjà pré-établi la faisabilité de ce type de modélisation. Pour mimer la phase la plus sévère de la maladie, nous devrons recréer les conditions pathologiques chez des souris assez âgées. Nous inoculerons donc les fibrilles chez des souris âgées de 12 mois, pour mimer l’âge tardif de survenue chez l’homme. Nous étudierons les effets de transfert des gènes thérapeutiques introduits via des vecteurs viraux dans le cerveau de ces souris, pour contrecarrer les mécanismes de la maladie. La mise en évidence d’un effet bénéfique de la thérapie génique sur les paramètres pathologiques, cliniques, cellulaires et biochimiques, des souris-modèles ouvrirait une possibilité nouvelle de traitement chez l’homme. En résumé, l’objectif du projet est d’établir un modèle préclinique pour tester un nouveau vecteur de thérapie génique, constituant ainsi la première étape d’une démarche translationnelle en direction de la maladie humaine. Cette démarche nécessite l’établissement d’une preuve de concept thérapeutique dans l’espèce souris.

La thérapie génique par vecteurs AAV est en plein développement dans plusieurs maladies humaines, notamment dans certaines affections neurologiques. Elle s’appuie sur une dizaine d’années d’essais chez l’homme (plus de 2000 patients, atteints de diverses maladies, ont reçu des vecteurs AAV). Elle est considérée comme un des principaux espoirs de traitement curatif, à condition de prouver ses effets, dans un premier temps, dans des modèles animaux pertinents. La maladie de Parkinson est une maladie neurodégénérative sévère dont la fréquence augmente chez les personnes de plus de 60 ans. Elle n’a pas de traitement curatif et son évolution est invalidante. Cette maladie est caractérisée par la mort de neurones dopaminergiques entraînée par l’accumulation anormale d’agrégats de protéines riches en alpha-synucléine (une protéine présente normalement sous forme non agrégée dans les neurones). Pour tester un traitement innovant notre objectif est de créer un modèle d’étude pertinent de la maladie chez la souris, en inoculant des fibrilles d’alpha-synucléine dans le cerveau. La mise en évidence d’un effet bénéfique de la thérapie génique dans notre modèle ouvrirait une possibilité nouvelle de traitement applicable à l’homme.

Chirurgie : Préparation de l’acte chirurgical et de l’anesthésie -Durée : 30 minutes -1 fois pour 90 souris -2 fois pour 90 souris à 3 mois d’intervalle Acte chirurgical : injection de fibrilles et/ou de vecteur thérapeutique et/ou d’une solution saline -Durée : 30 minutes -1 fois pour 90 souris -2 fois pour 90 souris à 3 mois d’intervalle Habituation à l’expérimentateur : 3 minutes par souris et par jour, durant 5 jours consécutifs Tous les 2 mois, 6 fois au total tests comportementaux : Trois types de tests comportementaux seront réalisés tous les 2 mois après l’injection de fibrilles sur afin d’évaluer la balance, la coordination et la force musculaire de l’ensemble des animaux. Ces tests vont permettre d’étudier les effets du traitement par transfert de gène thérapeutique dans le cerveau des souris pour contrecarrer les mécanismes de la maladie de Parkinson. test 1 : test de coordination Durée : 20 minutes/jour cad 4 passages d’environ 5 minutes max sur le rotarod avec 1 heure de repos entre chaque passage. Répétition : 3 jours consécutifs test 2 : test de balance Durée : 20 minutes par jour Répétition : 4 jours consécutifs test 3 : test de force musculaire Durée : 15 minutes Répétition : 3 jours consécutifs Ces trois types de tests seront réalisés au total 6 fois au maximum pour tous les animaux.

Les complications liées à aux chirurgies sont rares mais peuvent entrainer : – une altération grave du comportement, – des séquelles de traumatisme non-résolues par traitement, – un incident d’anesthésie avec séquelles (troubles respiratoires, fausse déglutition), – une hémorragie sévère en cours de chirurgie, – une perte de poids au cours de la semaine suivant l’intervention. L’injection de fibrilles d’alpha-synucléine entrainera un développement progressif de la maladie de Parkinson qui se traduira par des déficits moteurs (ralentissement des mouvements, perte d’équilibre). Ces symptômes devraient apparaitre environ 3 à 6 mois après l’injection de fibrilles dans le groupe des souris non traitées par vecteur thérapeutique. Une perte de poids peut en découler.

A la fin de l’étude, tous les animaux seront euthanasiés. Le but est de prélever les organes post-mortem des animaux, et d’effectuer des analyses biomoléculaires et histologiques. Les cerveaux et les foies de ces animaux seront prélevés. Le but est de regarder l’effet des vecteurs thérapeutiques sur les marqueurs de la maladie de Parkinson.

Toutes les constructions génétiques (vecteurs viraux) utilisées seront caractérisées in vitro avant leur utilisation chez l’animal. Des études in vitro sur des cultures de cellules ont déjà été menées. Cependant, elles ne nous permettent pas d’évaluer l’efficacité des constructions génétiques pour corriger les manifestations cliniques de la maladie à l’échelle de l’organisme entier.

La constitution des groupes est basée sur notre expérience et le type d’analyses réalisées nous permettant d’obtenir des données statistiquement significatives pour évaluer l’effet thérapeutique du traitement. Nous avons effectué une large recherche bibliographique afin de nous assurer de ne pas dupliquer des protocoles expérimentaux déjà réalisés. Cette recherche bibliographique nous a permis d’optimiser nos procédures et le nombre d’animaux à utiliser afin d’obtenir des résultats statistiques exploitables, robustes et valables. Les effectifs prévus ont été réduits au maximum. Ce nombre, validé par le un logiciel spécialisé, permettra de fournir un résultat fiable et statistiquement analysable pour chaque sous-groupe.

Pour l’administration des fibrilles et du vecteur thérapeutique, des protocoles anesthésiques et analgésiques adaptés seront mis en place selon la procédure. Nous surveillerons l’état de santé des souris tout au long de l’expérience, et de manière accrue en post-opératoire. Cela permettra une intervention immédiate et de appropriée si des signes de souffrance apparaissent et les points limites sont atteints. Tout au long de l’expérience un suivi précis des souris sera mis en place : pesées et observations hebdomadaires des animaux. L’application de critères de points limites permettra de veiller au bien-être des animaux. Afin de suivre l’apparition des signes cliniques de la maladie de Parkinson et d’évaluer l’effet du vecteur thérapeutique sur la maladie, un suivi précis des animaux sera mis en place à + 2 mois post-opératoire, âge à partir duquel les premiers signes cliniques de la maladie de Parkinson devraient apparaître : mise en place de tests de comportement tous les 2 mois afin de suivre une éventuelle modification du comportement de l’animal et le développement de déficits moteurs. Les souris seront habituées progressivement aux protocoles comportementaux et aux examinateurs. Cela permettra d’avoir un suivi régulier et proche des animaux. Enfin, nous assurerons le bien-être des animaux tout au long de l’expérimentation en limitant leur angoisse grâce au suivi des conditions d’hébergement, et d’utilisation de cages proposant un environnement riche.

Le choix de la souris comme espèce d’étude préclinique a plusieurs justifications : – l’établissement d’un modèle original chez la souris de la maladie de Parkinson à un stade avancé permettra des études des mécanismes de la maladie et permettra également de tester des traitements ; – l’existence de modèles souris de maladie peu sévère basés sur l’inoculation de fibrilles établit la faisabilité de notre projet ; – la grande majorité des études de thérapie génique commence dans un modèle de souris pathologique, et selon les résultats peut se déployer secondairement chez le primate ; – la petite taille du cerveau de souris est propice à la diffusion étendue des fibrilles, ainsi qu’à la diffusion du vecteur thérapeutique à partir de son point d’injection ; – la maitrise par notre équipe des tests moteurs chez la souris permet une étude fine des défauts neurologiques. Nous avons déjà testé des vecteurs comparables dans des souris modèles d’autres maladies. Nous utiliserons des souris âgées de 12 mois au moment de l’injection des fibrilles accompagnée ou non d’une injection de vecteur thérapeutique. Cela permettra de mimer l’âge avancé de la maladie humaine. Le comportement de ces souris sera étudié entre l’âge de 14 et 24 mois.