Rôle du facteur de transcription Foxk1 dans le mécanisme de tolérance périphérique exercée par les lymphocytes T régulateurs

La réponse immunitaire adaptative dépend fortement de l’immunité médiée par les lymphocytes T. Les cellules T conventionnelles (Tconv), peuvent reconnaître le non-soi et éliminer les cellules infectées et les cellules cancéreuses. La sélection thymique garantit que les lymphocytes T qui atteignent les organes lymphoïdes secondaires reconnaissent les pathogènes mais sont tolérés vis-à-vis du soi. Cependant, même si plus de 95 % des lymphocytes T sont supprimés dans le thymus au cours de la maturation, la tolérance centrale reste un processus imparfait, principalement en raison de l’expression incomplète, dans le thymus, de l’ensemble des antigènes du soi. C’est pourquoi il existe des mécanismes de tolérance périphérique, notamment des cellules T régulatrices (Treg), un sous-ensemble de cellules CD4+ exprimant le facteur de transcription FOXP3 qui peut supprimer l’activation des cellules T auto-réactives en périphérie. La tolérance est un processus essentiel à l’équilibre immunitaire normal et, lorsqu’elle est rompue, l’auto-immunité peut se développer. Le facteur de transcription appelé Foxk1 a été identifié comme un acteur clé de la régulation des cellules T, et possiblement des cellules Treg. Dans ce cadre, Le projet vise donc à caractériser le rôle d’un nouveau facteur de transcription dans les cellules Treg, et à déterminer si son absence induit une rupture de tolérance et conduit à de l’auto-immunité.

Un défi important dans la recherche biomédicale actuelle et son application pharmaceutique en immunologie est d’identifier les points de contrôle et les mécanismes moléculaires qui peuvent être ciblés pour contrôler les cellules T, et modifier leurs fonctions et leur devenir, afin de mieux contrôler les réponses auto-immunes. Dans ce contexte, la reprogrammation du métabolisme des cellules T apparaît comme une voie alternative et prometteuse pour moduler les réponses des cellules T. Ainsi, le projet présenté ici explore cette possibilité en se concentrant sur un nouveau facteur de transcription. Celui-ci constitue un candidat prometteur qui, en contrôlant le métabolisme des cellules T régulatrices pourrait donc faire l’objet d’une intervention pharmaceutique visant à Réduire les dommages de pathologies auto-immunes. Par ailleurs et au-delà de ce facteur de transcription, ce projet constitue une preuve de principe pour cibler les effecteurs impliqués dans les programmes métaboliques, offrant de nouvelles opportunités thérapeutiques pour reprogrammer les cellules T auto-réactives.

Les animaux impliqués dans ce projet seront traités au Tamoxifene par gavage (deux fois par semaine pendant 30 jours. temps de procédure: quelques minutes pour chaque souris) ou par l’utilisation de croquettes dédiées. La période d’administration s’étalera sur 50 jours. Des cellules T modifiées seront injectées par voie intraveineuse (1 seule injetion, temps de procedure: quelques secondes) sur souris anesthésiées par anesthésie gazeuse afin de déterminer leur effet in vivo. Une seule injection sera effectuée par souris, la procédure ne durera que quelques minutes.

Du fait des protocoles envisagés, des nuisances sont attendues sur les animaux. Certains lots d’animaux pourront développer des signes d’auto-immunité, conduisant à une perte d’appétit, une perte de poids et perte de sociabilité vis-à-vis des congénères.

Tous les animaux seront euthanasiés afin d’analyser l’impact de la délétion du gène Foxk1, les infiltrats cellulaires aux seins des organes lymphoïdes seront analysés. De manière générale, le suivie de la réponse immunitaire et en particulier des lymphocytes T, objet de l’étude, nécessite l’euthanasie des animaux à l’issue des procédures.

Il n’existe à ce jour aucune alternative à l’expérimentation animale lorsqu’il s’agit de modéliser les processus complexes de développement de la réponse immunitaire dans un auto-immun. Afin d’étudier de nouvelles approches d’immunothérapie, l’utilisation de modèles murins est cruciale.

Nous souhaitons étudier des populations cellulaires dont certaines sont rares mais dont la distribution suit une loi normale N ( μ = 15, σ = 3). Sur la base de nos expériences antérieures et des données de littérature, nous savons que des groupes de maximum 6 animaux, analysés avec le test two-tailed student’s test with welch’s correction nous permettent d’obtenir des résultats significatifs et doivent être réalisés en duplicat pour être publiables. La validité statistique des résultats (différence significative entre les groupes) sera évaluée par les tests statistiques suivants : two-tailed student’s test with welch’s correction ANOVA et/ou Mann Whitney.

Toutes les procédures expérimentales du projet sont réalisées en tenant compte du bien-être animal dans le strict respect des réglementations en vigueur et en étroite collaboration avec la structure du bien-être animal de notre établissement. Les expérimentations seront optimisées dans l’optique de réduire, supprimer ou soulager l’inconfort, la douleur ou l’angoisse subie par les souris afin d’obtenir des données fiables. Le nombre d’animaux adultes par cage sera au maximum de 5. Les animaux sont hébergés dans des cages dont la surface est de 500 cm2. L’état de santé des souris sera quotidiennement surveillé par du personnel compétent afin de déceler le plus précocement une altération du bien- être animal. Nous évaluerons la survie des souris en nous basant sur un taux de survie de 10% à 50 jours observé dans un modèle similaire de maladie auto-immune (Shi et al, 2019 ; Zhenh et al 2013).Tout au long de ces 50 jours (voir également fichier Annexe 1, les souris seront évaluées tous les 3 jours pendant les 20 premiers jours puis et tous les 2 jours pendant les 30 jours suivants ; Le poids, la posture, l’aspect de la peau, l’activité d’exploration et la mobilité, l’aspect du pelage et le comportement avec ses congénères seront évalués. Le score cumulatif obtenu permettra de définir des points limites précoces. En fonction du score, l’animal pourra être isolé, son environnement sera enrichi (nourriture en gel sur la litière, dome/maison) et des analgésiques/antalgiques (Acétaminophène) pourront lui être administrés afin de réduire la douleur jusqu’à sa mise à mort. Nous mettrons donc en place des actions pour limiter les douleurs de l’animal dans la mesure où celles-ci n’impactent pas les mesures expérimentales que nous voulons réaliser (ex : perte de poids, peau irritée, etc..). Pour un score > ou = 5 au cours de 2 observations successives (soit sur 4 jours), l’animal sera euthanasié est décompté comme succombant à la maladie. Les animaux survivants seront euthanasiés à l’issue des 50 jours. Dans la plupart de nos expériences outre la courbe de survie, nous suivrons nos animaux suivant la même grille de score tous les 3 jours pendant les 20 premiers jours puis et tous les 2 jours pendant les 10 jours suivants et mettrons à mort nos souris avant la phase très sévère de la maladie dans les 30-40 premiers jours théoriques du développement de la maladie. Les souris seront également mises sous anesthésie gazeuse lors des procédures de transfert adoptif.

Mus musculus, mammifères dont 99% des gènes sont orthologues à l’homme, animal de petite taille et à reproduction rapide, bonne connaissance anatomique, physiologique et biologique de ce modèle. Le système immunitaire adaptatif caractérisé par la présence de lymphocytes B et T en interaction avec les cellules dendritiques est issu de l’hématopoïèse laquelle est observée chez les vertébrés uniquement et sur le plan immunitaire, il existe de nombreuses similarités entre l’homme et le modèle souris. Les techniques de mutagénèses conditionnelles ne sont disponibles que chez les souris et sont validées pour les études physiopathologiques de gènes. La physiopathologie de la souris est suffisamment proche de celle de l’homme pour que son étude soit riche d’enseignements permettant d’accroître nos connaissances sur le fonctionnement du système immunitaire des 2 espèces, avec des applications cliniques potentielles pour l’homme. Par ailleurs, la taille, la rapidité du cycle de reproduction et la génétique de la souris en font le modèle le mieux approprié pour les études envisagées les animaux adultes seront utilisés à 8 semaines.