Evaluation de la toxicité et de l’efficacité de molécules à potentiel thérapeutique dans des modèles murins pour le traitement de maladies rares de la surface oculaire

Le défaut de cicatrisation de la cornée est le dénominateur commun de nombreuses maladies oculaires rares, ce qui représente un problème médical critique et un domaine où les besoins médicaux sont largement insatisfaits. Dans des maladies rares de la cornée, une inflammation, la croissance de nouveaux vaisseaux, une innervation défectueuse et un œdème conduisent à une perte de la transparence entraînant une baisse de la vision et la cécité. A ce jour, les traitements disponibles sont peu efficaces et provoquent des effets indésirables. Les objectifs dans ce projet de recherche sont d’investiguer et de proposer de nouvelles alternatives pour le traitement de maladies affectant la surface oculaire. Ainsi, la tolérance et l’efficacité de composés nouveaux et déjà existants seront évaluées dans des modèles expérimentaux animaux afin de comprendre les mécanismes physiopathologiques de ces maladies ainsi que les mécanismes d’action des traitements proposés.

Ce projet consiste en des tests précliniques de toxicité et d’efficacité en utilisant des modèles expérimentaux animaux pertinents qui doivent être réalisés au préalable pour évaluer la sécurité et l’efficacité de ces médicaments avant d’aller chez l’homme. Les maladies oculaires, de manière générale, ont tendance à provoquer de nombreux effets délétères chez les patients touchés, en plus du risque de cécité permanente. Cependant, parmi le vaste groupe de maladies pouvant affecter l’œil, il en existe certaines qui sont considérées comme rares et qui, malgré leur gravité, ne sont généralement pas une priorité en termes de recherche et de développement, précisément en raison de leur faible incidence et prévalence dans la population en général. En Europe, environ 30 millions de personnes souffrent de cécité et de déficience visuelle. Il est estimé qu’il y a environ 500 000 patients qui souffrent de maladies rares de la surface oculaire, ce qui représente environ 1.7 pour cent de la population totale atteinte de déficiences visuelles et de cécité eu Europe. Parmi ces maladies rares, la néovascularisation cornéenne conduisant au rejet de greffe et à la cécité représente une prévalence de 1 à 10 cas pour 50 000 personnes. Le déficit en cellules souches limbiques, une autre maladie rare de la surface oculaire dans laquelle les patients présentent une altération de la cicatrisation épithéliale cornéenne et des ulcères cornéens chroniques pouvant mener à des perforations cornéennes, représente une prévalence de 1 cas pour 8 000 personnes en Europe. Dans ce contexte, les études précliniques revêtent d’une importance primordiale pour filtrer et proposer des schémas thérapeutiques qui pourront être transposés aux patients, tout en garantissant la sécurité des doses proposées avec le moins d’effets indésirables possible. Tous les médicaments suggérés présentent des données préliminaires montrant des effets remarquables dans la restauration de la physiologie cellulaire, immunitaire, avasculaire, neuronale et environnementale de signalisation dans la cornée dans le contexte de maladies rares, depuis les modèles animaux jusqu’aux essais cliniques. Les résultats attendus dans ce projet sont susceptibles de constituer une avancée majeure pour les patients qui souffrent depuis trop longtemps de maladies débilitantes et progressives sans avoir accès à un traitement adéquat et abordable.

L’induction des modèles pathologiques dure entre 10 à 15 minutes. Les lésions cornéennes sont réalisées après anesthésie générale et locale. Un analgésique est également administré 30 minutes avant la réalisation de l’acte. Suivant le modèle utilisé, l’analgésique est administré pendant 3 à 5 jours après l’induction de la lésion cornéenne. L’évaluation de la douleur est réalisée par un test comportemental en appliquant une pression sur la patte et en mesurant la réponse de retrait ainsi qu’en observant les signes comportementaux. Les collyres sont administrés à l’aide d’un flacon contenant un compte-gouttes dans les deux yeux. L’administration des gouttes est réalisée sur animal vigile par contention physique. Les injections sous-conjonctivales se réalisent sous microscope opératoire après anesthésie générale. L’acte ne dure que quelques secondes. Les examens in vivo afin d’évaluer la morphologie et la transparence cornéennes sont réalisés après anesthésie générale et durent entre 5 à 10 minutes chacun. Pour l’évaluation de la toxicité des gouttes, des examens in vivo sont réalisés le premier jour puis 7 jours après sur l’ensemble des animaux. Pour l’évaluation de la toxicité du traitement administré en sous-conjonctival, les examens in vivo sont réalisés le premier jour puis 4 jours après sur l’ensemble des animaux. Dans le modèle expérimental de cicatrisation cornéenne, les examens in vivo sont réalisés à avant l’induction du modèle puis après 6h, 24h, 48h et 72h sur l’ensemble des groupes expérimentaux. Dans le modèle expérimental de dommages cornéennes induites par l’exposition au rayonnement ultraviolet B (UVB), les examens in vivo sont réalisés avant l’induction du modèle puis 3, 5, 7, 10, 14 et 16 jours après sur l’ensemble des animaux. Un examen d’angiographie in vivo pour la visualisation des néovaisseaux cornéens est réalisé une seule fois au 14ème jour. Dans le modèle expérimental d’insuffisance limbique, les examens in vivo sont réalisés le premier jour puis 3, 7 et 14 jours après sur l’ensemble des animaux.

Les traitements évalués dans ce projet ne contiennent que des excipients connus et approuvés pour un usage oculaire et des études antérieures ont montré que ces excipients n’entraînent pas ou très peu d’effets indésirables. Les doses sont faibles étant donné que les formulations sont administrées localement. La quantité de produit qui traverse les barrières oculaires et se retrouve dans le sang est négligeable. La préhension des animaux vigiles et l’administration topique des formulations en contention physique peuvent entraîner un stress. Avant l’induction des modèles expérimentaux, les animaux sont anesthésiés par voie générale en intrapéritonéal. L’injection peut entraîner une douleur lors de la piqure et l’anesthésie peut mener à des problèmes respiratoires, dépression ou encore d’hypothermie. Après l’induction des modèles expérimentaux, les animaux sont susceptibles de ressentir une douleur. Une infection de la surface oculaire comprenant des rougeurs et des sécrétions peut également survenir après l’induction des modèles.

Les animaux seront tous euthanasiés à différents délais pour le prélèvement de tissus oculaires afin de mieux analyser les effets des traitements à l’issue de toutes les procédures.

Avant de passer chez l’homme, il est impératif d’évaluer la toxicité des molécules dans des modèles pertinents qui se rapprochent le plus possible des mécanismes complexes chez l’homme. Les rongeurs restent l’une des espèces la plus utilisée pour l’évaluation de la tolérance des médicaments dans le domaine de l’ophtalmologie. Des modèles expérimentaux animaux seront également utilisés afin d’étudier les mécanismes physiopathologiques visibles uniquement à l’échelle de l’animal. Travailler sur l’animal entier est devenu une nécessité pour étudier les mécanismes physiopathologiques intégrés, les lignées cellulaires ne pouvant pas reproduire les mécanismes complexes d’adaptation d’un organisme. Toutes les études plus spécifiques sur les mécanismes plus délimités seront effectuées avec des cultures cellulaires. Dans cette étude, il est impératif de passer par l’animal avant de procéder à des tests cliniques chez l’homme.

Au total, 2400 rats seront utilisés dans ce projet qui englobe l’évaluation de la toxicité et de l’efficacité de 5 molécules à potentiel thérapeutique pour des maladies rares de la surface oculaire. Une étude de la littérature ainsi qu’une estimation grâce à un test de puissance ont été réalisées pour s’assurer de la faisabilité du projet ainsi que pour estimer le nombre d’animaux nécessaires. Cela permettra également de mettre en évidence des différences statistiques entre les résultats de nos différents groupes. Les analyses in vivo dans le temps chez le même animal permettront de diminuer le nombre d’animaux euthanasiés.

Une semaine d’acclimatation est mise en place avant toute manipulation des animaux. Ceci leur permet de récupérer de leur transport et de s’habituer aux nouvelles conditions de vie. Les rats seront hébergés en portoirs ventilés en pression positive avec enrichissement du milieu tunnels en carton ou en plastique et ou maison en plastique au sol ou accrochée à la grille afin que ces derniers soient dans un environnement qui leur soit le plus adapté possible. La stabulation sera conventionnelle et les animaux recevront un régime alimentaire normal. Ils seront suivis quotidiennement pendant les périodes d’évaluation, ainsi que pendant les phases de repos afin de s’assurer de leur bien-être et de pouvoir apporter rapidement des soins le cas échéant. Les animaux sont anesthésiés par voie générale et locale lors de l’induction des modèles expérimentaux. Afin d’éviter l’hypothermie pendant l’anesthésie, les animaux sont placés sur tapis chauffant. Les procédures utilisées dans le projet pouvant entraîner une souffrance modérée pour les animaux, des mesures de prévention et des points limites précoces ont été mis en place afin de Réduire ou éviter la douleur. Les animaux seront pesés avant l’induction des modèles expérimentaux puis pendant toute la durée des procédures.

Les rongeurs dont les rats sont l’une des espèces les plus choisies car il s’agit d’un modèle établi pour le développement de différentes pathologies dont des maladies oculaires humaines de la surface oculaire. Par ailleurs, il existe de nombreux outils d’analyse en ophtalmologie qui ont été développés notamment pour la réalisation d’examens fonctionnels in vivo. Par rapport à la souris, le rat est plus facile à manipuler pour l’induction des modèles expérimentaux. La taille de l’œil du rat est plus importante que celle de la souris, ce qui permet une meilleure manipulation, un meilleur contrôle et reproductibilité lors de l’induction des modèles et facilite la réalisation des imageries in vivo. Des rats jeunes adultes entre 6 à 8 semaines et entre 10 à 12 semaines seront utilisés dans ce projet. L’âge choisi est en accord avec ce qui est fait dans la littérature pour ces types d’expériences et de modèles expérimentaux. Il s’agit de modèles de pathologies survenant à l’âge adulte.