Impact du stress in utero sur l’inflammation et la douleur

Influencés par une variété de facteurs environnementaux, les maladies allergiques connaissent une augmentation constante de leur prévalence à l’échelle mondiale, tant dans les pays développés que dans les pays en voie de développement. D’une façon intéressante, ces maladies sont souvent déclenchées ou aggravées par le stress chronique, bien que les données biologiques expliquant ces phénomènes restent largement incomplètes. Notre projet a donc pour objectif d’examiner l’effet du stress sur la susceptibilité à développer une inflammation allergique, et le cas échéant, de dévoiler les mécanismes moléculaires responsables de cet effet. En effet, la période prénatale est une période critique durant laquelle tous les systèmes physiologiques, y compris les systèmes nerveux et immunitaire, développent leurs fonctions spécifiques et apprennent à s’adapter aux éventuels stimuli déclencheurs. Nous avons récemment mis en évidence l’existence de ce qu’on appelle ‘unités sensorielles’ dans la peau, formées par les mastocytes (cellules immunitaires spécialisées) et les neurones sensoriels (responsables de la détection de stimuli sensoriels), qui contribuent au développement de l’inflammation allergique de la peau. Nous éméttons donc l’hypothèse que le stress, plus particulièrement le stress prénatal, pourrait contribuer au développement de l’inflammation de la peau de la descendance in utero, en perturbant, au moins en partie, les phénotypes des mastocytes et des neurones sensoriels, et donc les unités fonctionnelles neuro-immunes cutanées associées.

Le présent projet aborde une question clé en explorant le rôle de l’exposition du fœtus au stress prénatal et ses conséquences sur la susceptibilité à développer une inflammation après la naissance. Il permettra de dévoiler, pour la première fois, les mécanismes biologiques sous-jacents activés par l’exposition au stress. Cela apportera des informations inestimables sur d’éventuels événements indésirables prénataux associés au développement des caractéristiques classiques de l’eczema pédiatrique, donnant lieu à des publications de haut niveau, protégées par des brevets découvertes et, surtout, de nouvelles options thérapeutiques/préventives potentielles pour les troubles allergiques.

– procédures 1/3: Les souris seront mises en stress de contention sous une lumière vive, 3 fois par jour durant 30 minutes, sur 6 jours consécutifs. Nombre de souris: 140 (P1)+162 (P3) = 302 – procédure 2: Un pansement imbibé d’une solution physiologique sera déposé sur le dos des souris, sous anésthésie, 2 fois par semaine (lundi et mercredi, 3-5min par souris), pour une durée de 3 semaines (3 cycles au total). Nombre de souris: 504 – procédure 4: Les souris seront injectées au jour embryonnaire 7.5 ou E10.5 en intra-péritonéal (~1min/souris). Nombre de souris: 360 – procédure 5: Les souris seront injectées en intra-péritonéal avant chaque session de stress (~1min/souris), voir trois fois par jour, sur 6 jours consécutifs. La génération F1 sera patchée (3-5min par souris). Nombre de souris: 276

Dans le projet proposé, les souris subiront des procédures de classe modérée qui pourraient avoir des effets indésirables ou des nuisances. Les principales nuisances attendues sur les animaux incluent: (1) comportements anormaux liés au stress comme la prostration, isolement, absence de nettoyage (bien que nous n’ayons pas observé de nuisance qui perturberait le comportement soit de la souris stressée, soit de la descendance dans les expériences que nous avons déjà faites en accord avec le protocole éthique précédent utilisant ce modèle); (2) Irritation cutanée due à l’application du patch: l’application de patch peut causer une légère gêne cutanée, une irritation temporaire sur la zone d’application et une légère inflammation; (3) Les injections pourraient causer une douleur passagère au site d’injection et un stress modéré due à la manipulation répétée. Ces effets indésirables vont être soigneusement surveillés et gérés pour minimiser l’impact sur le bien-être des animaux, en appliquant les mesures de Raffinement appropriées décrites dans la section 5.10.3.

Tous les animaux seront euthanasiés à l’issue de la procédure correspondante: – Les souris mâles utilisées pour les accouplements seront séparées et proposées à la communauté scientifique. – Les souris femelles utilisées pour les accouplements et subissant le stress seront euthanasiées ou bien au jour embryonnaire E18.5 ou bien après le sevrage (semaine 3). – Les souris de la descendance seront euthanasiées à E18.5 ou à la semaine 8 avant toute intervention ou après le patch.

Ce projet vise à identifier les mécanismes biologiques, induits par l’exposition au stress durant la gestation. Il n’existe à ce jour aucun modèle cellulaire qui peut substituer l’usage d’animaux pour investiguer cela. La substitution également par l’humain n’est pas évidente, étant donné que le niveau de stress est relatif à chaque personne (ce qui sera source de variabilité pour notre étude), et l’accès à des échantillons de foetus ou de mamans durant la gestation/ou atteints d’éczema n’est pas toujours possible. Le modèle murin est donc un élément clé et incontournable pour étudier l’effet du stress prénatal sur le dialogue entre neurone sensoriel et mastocyte dans le cadre de l’inflammation de la peau.

L’expérience du porteur du projet dans le modèle de stress prénatal et de patch de peau (protocoles éthiques obtenus précedemment) et la présence de data préliminaires nous permet d’anticiper et d’optimiser le nombre d’animaux à analyser dans chaque modèle. Nous utiliserons une moyenne (12 femelles par groupe, par génotype, réparties entre controle et stress). Ce nombre pourra éventuellement varier à la hausse ou à la baisse (+/- 3 animaux par groupe) en fonction des résultats expérimentaux obtenus avec chaque génotype analysé pour chacun des modèles étudiés. Ces femelles seront accouplées avec 8 mâles aux génotypes correspondants, pour un rapport 2mâles x 3femelles. Les expériences qui seront réalisées, in vivo, ont été conçues de façon à n’utiliser que le nombre strictement minimum de souris nécessaire à l’obtention de données validées statistiquement (nombre déterminé sur la base de la littérature et de l’expérience des porteurs du projet dans les expériences réalisées.

Jusqu’à présent, le taux de mortalité issu des expériences proposées n’atteint pas les 0.1%. Quant au modèle de patch ou de stress, aucun taux de mortalité n’a été détecté jusqu’à présent. D’autre part, lors de la mise en place des procédures expérimentales l’état clinique des animaux sera monitoré régulièrement. Nous analyserons les paramètres suivants : poids, température, signes extérieurs de stress tels que le comportement de prostration ou l’aspect du pelage (poils luisant ou bien collé et gras etc). Si nécessaire, des antalgiques seront administrés (surtout si des effets indésirables liés au patch surviendront bien qu’aucune manipulation précédente n’a impliqué cela). Si lors d’une procédure expérimentale nous détectons une perte de poids équivalente à 20% du poids d’origine, ou bien des signes de baisse de température (isolement, mouvement moindre, confirmée par la prise de la tempéraure corporelle et détéction d’une baisse de 3° par rapport à la température d’origine), les animaux seront euthanasiés. Ces cas de figure n’ont encore pas été présentés lors des procédures employées dans d’autres protocoles éthiques déjà validés. Enfin, nous utiliserons des techniques de préhension adaptée (main en coupe ou igloo) aux souriceaux afin d’éviter un stress supplémentaire et maintenir le bien-être des souris. Les injections seront aussi réalisées par un personnel compétent pour éviter la douleur des souris. Les souris mâles mis en accouplement seront réutilisés par d’autres expérimentateurs.

La souris représente le modèle animal le plus utilisé pour étudier la physiopathologie des maladies humaines, surtout l’inflammation de la peau (taux de similarité important). En effet, l’élevage de souris est très productif et nécessite peu de place. Les connaissances et avancées technologiques actuelles permettent de disposer de nombreux modèles sophistiqués transgéniques, qui dans notre cas, permettront l’étude du rôle des mastocytes et des neurones sensoriels, et l’effet du stress sur ces cellules. D’ailleurs, la majorité des animaux transgéniques nécessaires à la réalisation de ce projet sont uniquement disponibles chez la souris et sont déjà disponibles dans le laboratoire. L’utilisation de méthodes alternatives (ex. avoir recours à des biopsies humaines, etc. sera d’un grand intêret mais cependant limite le projet, étant donné que les niveaux de stress sont relatifs à la personne en question, ce qui apportera une variabilité dans nos analyses. Trois stades/périodes de développement seront d’intêret durant notre projet: 1- Jour embryonnaire E13 à E18: cette période de gestation sera la période durant laquelle les sessions de stress seront conduites. Non seulement cette période est celle décrite pour le modèle, mais elle correspond également à la période de développement des cellules d’intêret, y compris les neurones et les mastocytes. 2-Jour embryonnaire E18.5: les souris gestantes seront euthanasiées et les foetus prélévés, euthanasiés et analysés pour les études à l’état basal. Ce stade représente le dernier jour du protocole de stress ainsi qu’un time-point où les neurones et les cellules immunitaires sont déjà présents dans la peau des souris. 3- Semaine 8: les souris de la génération F1 seront patchées à l’âge de 8 à 12 semaines car elles présentent un système immunitaire mature à ce stade. Le modèle de patch dure 3 semaines, les souris seront euthanasiées à la fin du modèle.