Mise en place et caractérisation phénotypique d’un modèle murin d’encéphalopathie du prématuré.

Une naissance est considérée comme prématurée lorsqu’elle intervient avant 37 semaines et se positionne comme un véritable problème de santé mondiale avec une incidence de 15 millions de cas par an. La prématurité est notamment associée à un large spectre d’altérations globales du développement se manifestant sous la forme de troubles moteurs, sensitif (e.g. vision), d’une altération des fonctions cognitives ou encore de troubles de l’attention et de l’hyperactivité. Ces déficits neurologiques qui peuvent demeurer observables jusqu’à l’âge adulte sont caractérisés au niveau morphologique par un ensemble d’anomalies cérébrales qui sont regroupées sous le nom d’encéphalopathie du prématuré.

D’un point de vue scientifique, cette étude va nous permettre d’acquérir des données fondamentales pour mieux comprendre différentes pathologies neurodéveloppementales humaines. Les procédures expérimentales ont un caractère de stricte nécessité et ne peuvent pas être remplacées par d’autres méthodes expérimentales n’impliquant pas l’utilisation d’animaux vivants et susceptibles d’apporter le même niveau d’information. En effet, l’étude phénotypique de l’encéphalpathie du prématuré doit s’effectuer sur des modèles in vivo. De plus, les méthodes ex vivo de ce projet seront réalisées en parallèle afin de Réduire le nombre d’animaux et pour mieux caractériser les processus moléculaires et cellulaires sous-jacents.

L’ensemble des souriceaux recevront une injection intra péritonéale d’un extrait de proteine bactérienne afin de reproduire l’encéphalopathie du prématuré (N =2160). Aux jours post-nataux (P) 3, 5, 7, 10, 15, 30 et 60 une imagerie par résonance magnétique (50 minutes maximum, n = 420) et une imagerie fonctionnelle échographique (1 heure maximum, n = 420) seront réalisées avec une injection intraveineuse de l’agent de contraste au préalable. La méthode la plus efficiente pour cette administration sera évaluée dans une procédure de mise au point (40 souriceaux seront concernés par cette procédure de mise au point). Deux procédures chirurgicales d’une durée de 45 minutes seront réalisées afin de poser des prothèses de contention qui permettront d’éviter les artéfacts de mouvements de la tête lors des acquisitions en imagerie fonctionnelle échographique (n = 420) et en microscopie (n = 280). Les tests comportementaux seront réalisées de manière longitudinale à P3, P5, P7, P10, P15, P30 et P60 (n = 240).

Les nuisances et effets indésirables étant susceptibles d’apparaître chez les animaux seraient : Pour toutes les procédures : une perte de poids, des douleurs post-opératoires, du stress, des déficits fonctionnels et/ou cognitifs. Lors des tests comportementaux, les animaux peuvent être soumis à un stress dû à la manipulation, l’isolement ainsi qu’à la nouveauté. Durant les examens d’imagerie, les animaux peuvent subirent un stress dû à la manipulation. Tous les animaux auront un suivi attentif et régulier par l’expérimentateur et le personnel animalier qualifié notamment grâce à la prise journalière du poids des animaux, leur observation dans la cage en s’assurant de leur bien-être (prise alimentaire et boisson).

L’ensemble des animaux utilisés dans ce projet feront l’objet d’une mise à mort à la fin de chaque procédure afin de générer des tissus permettant des observations sur des coupes de tissu.

Les procédures expérimentales pour réaliser ce projet ont un caractère de stricte nécessité et ne peuvent pas être remplacées par d’autres méthodes expérimentales n’impliquant pas l’utilisation d’animaux vivants et susceptibles d’apporter le même niveau d’information. Les conditions d’élevage, d’hébergement, de soin et les méthodes utilisées sont les plus appropriées pour respecter le bien-être de l’animal. Le projet est justifié d’un point de vue scientifique car il permettra des recherches fondamentales, translationnelles et/ou appliquées pour le diagnostic et le traitement de différentes pathologies humaines (encéphalopathie du prématuré, inflammation).

Notre projet ne nous permet pas d’utiliser d’autres moyens que l’expérimentation animale. Avant de procéder à une telle étude, nous nous sommes assurés d’utiliser le nombre minimal d’animaux adéquat pour atteindre le résultat souhaité. Ainsi, les procédures expérimentales décrites dans ce projet ont un caractère de stricte nécessité et ne peuvent pas être remplacées par d’autres méthodes expérimentales n’impliquant pas l’utilisation d’animaux vivants et susceptibles d’apporter le même niveau d’information disponible. Dans chaque phase du projet, le minimum d’animaux a été prévu afin d’arriver à des résultats qui soient en adéquation avec ceux prévus lors de ce projet. Le nombre d’animaux pour chaque étude a été défini à partir de l’expertise au sein du laboratoire et des données de la littérature. De plus, les analyses comportementales et les analyses morphologiques ne seront pas réalisées chez les mêmes animaux pour éviter la récupération fonctionnelle et donc le biaisement des résultats. Aussi, le projet comporte deux procédures de mise au point qui permet de s’assurer que les suivantes seront réalisées de la meilleure façon. Ce point limitera l’utilisation d’animaux pour des expériences qui ne marcheraient pas. Enfin, l’effet sexe sera observé, ce qui permettra de limiter l’utilisation d’animaux pour des résultats qui seraient biaisés par ce paramètre.

Afin de souscrire au principe de Raffinement, les animaux seront anesthésiés et analgésiés avant, pendant et après chaque procédure le nécessitant. Au cours de l’intervention chirurgicale (pose du support de tête pour limiter les mouvements de la tête lors des examens d’imagerie), les paramètres vitaux de l’animal seront surveillés et optimisés tout au long de la procédure. Les yeux des souris seront couverts avec du gel oculaire afin de ne pas les éblouir avec la lampe de la loupe binoculaire et prévenir de la déshydratation. Après l’intervention chirurgicale, les animaux seront surveillés jusqu’à leur réveil. Pour optimiser le réveil de l’animal, la cage de réveil chauffée. De la nourriture humidifiée sera déposée dans la cage pour un accès plus simple à l’alimentation après la chirurgie.

La souris est l’espèce animale la plus étudiée dans le domaine du développement et les techniques employées sont bien connues. De plus, la souche utilisé dans ce projet est également utilisée comme fond génétique de plusieurs lignées génétiquement modifiées utilisées au laboratoire et qui pourront, plus tard, être éventuellement utilisées dans le cadre de ce projet. L’anatomie du système nerveux murin et la physiologie de la souris sont également bien connues et sont proches de celles de l’Homme. Par ailleurs, les modèles d’encéphalopathie du prématurés induits par des stimuli inflammatoires sont très souvent utilisés car ils reproduisent parfaitement les caractéristiques de la pathologie humaine, ce qui en fait un modèle d’étude robuste. De même, il est admis que l’inflammation systémique induit des changements au sein du compartiment vasculaire comme dans ses interactions avec les cellules qui l’entourent. Cet ensemble de connaissances et les acquis dont nous disposons au laboratoire et dans la littérature rendent cette espèce particulièrement intéressante pour cette étude. Les procédures sont basées sur un stimulus inflammatoire à partir du premier jour post natal. Il est donc nécessaire de se procurer des femelles gestantes en amont afin de limiter le stress du voyage aux nouveau-nés. Le stade de développement de ces femelles est de 2 à 5 mois car nous devons attendre leur maturité sexuelle. La procédure de mise au point engendrera une évaluation comportementale au 7ème jour post natal chez les souriceaux. A ce même stade, une mise au point du protocole d’injection de l’agent de contraste pour les examens d’imagerie sera réalisée. En effet, cet agent de contraste nécessite d’être injecté en intraveineuse mais la voie habituellement utilisée (dans la veine caudale de la queue) n’est pas réalisable à ce stade de développement précoce. Une analyse microscopique sur coupes de tissus prélevés au 15e jour post natal permettra de voir si le modèle récapitule bien l’atteinte la plus décrite dans l’encéphalopathie du prématuré. De plus, au cours du développement physiologique et pathologique chez la souris, les changements fonctionnels, morphologiques comme les processus cellulaires et moléculaires en jeu s’opère très rapidement. De ce fait, une analyse à de nombreux stades de développement (jours poast nataux 3 / 5 / 7 / 10 / 15 / 30 / 60) est nécessaire afin d’identifier des différences dans le développement des différents groupes.