Développement pré-clinique du traitement d’une maladie immunitaire génétique rare par thérapie génique chez la souris

Ce projet étudie une maladie auto immune sévère se manifestant chez les garçons, souvent fatale dans la petite enfance. Cette pathologie est la conséquence de mutations dans un gène essentiel dans la régulation des cellules immunitaires, entrainant une déficience des lymphocytes régulateurs. Les traitements actuels ne sont que partiellement efficaces, aussi nous proposons de développer une nouvelle alternative thérapeutique pour contrôler les manifestations autoimmunes chez ces patients. Celle-ci repose sur une thérapie génique des lymphocytes, grâce au transfert d’une copie saine du gène essentiel dans la régulation des cellules immunitaire pour restaurer le compartiment de lymphocytes régulateurs. Nous avons développé un vecteur viral permettant l’expression de ce gène thérapeutique et montré son efficacité dans des tests in vitro ainsi que dans le modèle murin de la pathologie. La dernière étape pour permettre le dépôt de l’essai clinique chez l’homme (requise par l’Agence Nationale de Sécurité du Medicament) est la validation de l’efficacité et de l’absence de toxicité des lymphocytes humains ainsi modifiées, chez la souris humanisée. Pour ce faire nous utiliserons l’un des modèles classiques pour évaluer la fonctionnalité des lymphocytes régulateurs humains, qui est le modèle de « maladie du greffon contre l’hôte ».

A terme, ces expériences permettront d’établir l’efficacité suppressive des lymphocytes modifiées avec le gène thérapeutique essentiel dans la régulation des cellules immunitaires à prévenir la maladie du greffon contre l’hôte dans un modèle pré- clinique de souris humanisées. Il s’agit d’un prérequis nécessaire au développement clinique de cette nouvelle stratégie thérapeutique pour les patients atteints de ette maladie auto-immune sévère.

Injection intraveineuse : 1x, 1min par intervention Injection intrapéritonéale: 9X , 30s par intervention. Injection en sous-cutanée:13X, 10s par intervention. Prelevement sanguin en vigile: 6X, 30s à 2min. Imagerie intravitale : 6X, 10min par intervention

Les altérations génétiques des animaux utilisés dans le projet provoquent une immunodéficience sévère qui les rend vulnérables aux infections microbiennes. Le traitement appliqué aux souris peut provoquer une douleur transitoire durant les heures qui suivent l’injection intrapéritonéale. L’anesthésie gazeuse ou par injection intrapéritonéale peut provoquer une baisse de la température corporelle et un assèchement des yeux. L’injection de cellules en intraveineuse et sous anesthésie peut provoquer un stress transitoire. Les prélèvements de sangs réalisés sur la veine mandibulaire peuvent provoquer une légère douleur et du stress. L’administration par injection sous-cutanée ou intrapéritonéale peut provoquer une douleur légère et un stress. L’imagerie intravitale peut provoquer chez les animaux un stress et une baisse de la température corporelle liée à l’anesthésie gazeuse prolongée nécessaire à sa mise en œuvre. La maladie du greffon contre l’hote peut provoquer une douleur modérée au niveau cutanée, digestif, pulmonaire. Les manifestations de douleurs peuvent se traduire par des troubles comportementaux, physiologiques et une perte de poids. Pour limiter cette souffrance les animaux seront surveillés quotidiennement à l’aide du score clinique et les souris seront mises a mort si le point limite est atteint.

Tous les animaux inclus dans ce projet seront mis à mort à la fin de cette procédure car nous avons besoin de prélever leurs organes afin de realiser plusieurs analyses moléculaires et histologiques. Les animaux non inclus dans la procédure seront mis à mort quand il dépasse l’âge prévu de la procédure.

Afin de caractériser le vecteur de thérapie génique et les cellules humaines corrigées à l’aide de celui-ci, nous avons réalisé plusieurs études in vitro afin d’optimiser la préparation du produit thérapeutique. La dernière étape requise pour le dépôt de l’essai clinique auprès des agences réglementaires est une étude chez l’animal afin de s’assurer de l’efficacité et l’absence de toxicité dans un modèle animal proche de l’homme.

Nous avons développé un score d’évaluation clinique de la maladie dans ce modèle de souris, afin de Réduire les variations entre animaux et leur nombre requis par les exigences statistiques. Sur la base de nos résultats préliminaires et les données de la littérature nous avons réalisé une étude statistique sur le nombre d’animaux requis pour mesurer une différence significative de score entre les groupes, afin de déterminer le nombre d’animaux nécessaires pour notre étude. Nous aurons recours à plusieurs tests statistiques destinés à Réduire les lots du projet de manière optimale. Par ailleurs, nos élevages de souris seront synchronisés en amont de chaque expérience de manière à utiliser au maximum les animaux de chaque portée.

Afin de limiter la souffrance et l’angoisse des animaux, une surveillance rapprochée et l’utilisation d’antalgiques sont prévues. Les animaux seront hebergés sur portoir ventilé avec un accès à la nourriture et à la boisson ad libitum. Chaque cage bénéficie d’un enrichissement matérialisé par un tunnel translucide rouge destiné à diminuer le stress et stimuler leur activité, des carrés de cellulose afin de favoriser la nidification et un bâtonnet en bois pour répondre aux besoins naturels des rongeurs. Chaque procédure douloureuse sera précédée d’une anesthésie gazeuse ou une anesthésie par injection. Lors des prélèvements de sang, un anesthésique local sera appliqué à l’œil afin de diminuer la douleur qui suit la manipulation. Les animaux seront pesés trois fois par semaine en même temps que le suivi du score de la maladie afin de surveiller toute perte de poids ou comportement anormal. Des points limites ont été établis afin d’anticiper la mise a mort de l’animal si nécessaire. Une surveillance quotidienne sera réalisée par le personnel compétent de l’animalerie ainsi qu’une surveillance trois fois par semaine par les responsables du projet.

La souris est un modèle de référence pour étudier le devenir et le comportement de cellules du système immunitaires humaines. L’induction de maladie du greffon contre l’hôte est reconnu comme un modèle pertinent et robuste, avec une pathologie proche de celle survenant chez l’homme. Ce modèle est très utilisé pour tester l’efficacité de traitements de cellules régulatrices. Des souris agées de 8 à 12 semaines seront utilisées pour harmoniser les poids et les suivis entre les expériences. C’est le stade de développement classiquement rapporté dans la littérature pour ce modèle. Ce stade est justifié aussi dans le cadre du développement d’un modèle d’évaluation de traitement pour une pathologie auto-immune pédiatrique.