Etude de la fonction des cellules endothéliales en contexte physiologique, de régénération du thymus et de dissémination leucémique.

Notre projet de recherche porte sur la régulation du développement des lymphocytes T (LT). Les LT se développent au sein du thymus, hébergeant leur production et leur sélection. Or, le thymus est un organe extrêmement sensible aux perturbations de la physiologie tel que le vieillissement. En effet, avec l’âge, le thymus subit une Réduction drastique en taille et en fonctionnalité. Ce processus résulte en une forte altération de la production de nouveaux LT, réduisant ainsi fortement leur renouvellement dans l’organisme. Ceci résulte en une susceptibilité accrue de l’organisme aux infections, aux pathologies auto-immunes et aux cancers. De manière intéressante, notre équipe a identifié que l’administration d’une protéine ligand-X capable de se fixer sur un récepteur-Y spécifique présent sur les cellules du thymus promeut la régénération de cet organe et la production des LT au cours de l’involution associée à l’âge. Nos résultats montrent que l’action de cette molécule est médiée par une amélioration du nombre et de la fonction des cellules des parois des vaisseaux sanguins. Ce projet s’intéresse à comprendre comment ce Ligand-X agit sur la fonction des cellules des parois des vaisseaux sanguins du thymus. Ainsi, le premier objectif de notre projet est de caractériser le rôle de l’axe ligand-X/ récepteur-Y dans la physiologie des cellules des parois des vaisseaux sanguins thymiques ainsi que de déterminer le rôle de ces cellules dans la régénération du thymus. De plus, puisque le ligand-X est important pour la fonction des cellules des parois des vaisseaux sanguins thymiques et que nos résultats démontrent que les cellules leucémiques produisent fortement cette protéine ligand-X, nous émettons l’hypothèse que l’axe ligand-X/récepteur-Y dans les cellules des parois des vaisseaux sanguins est impliqué dans la dissémination des cellules leucémiques. Ainsi, le deuxième objectif vise à démontrer et caractériser le rôle de cet axe dans les cellules des parois des vaisseaux sanguins thymiques au cours de la leucémie. Ce projet permettra d’évaluer le rôle de l’axe ligand-X/récepteur-Y dans la fonction des cellules des parois des vaisseaux sanguins thymiques en contexte physiologique, de régénération du thymus, de dissémination leucémique et de réponse vaccinale.

Du fait du vieillissement progressif de la population et de l’amélioration de l’espérance de vie, l’immunodéficience liée à l’âge, étroitement corrélée avec le processus d’involution thymique, devient une préoccupation de santé publique majeure. Notamment, de nombreuses études révèlent un lien étroit entre le vieillissement et l’incidence des cancers. Ainsi, notre projet est susceptible d’avoir des retombées majeures dans la compréhension et la lutte contre le vieillissement immunitaire. A moyen terme, notre étude évaluera le rôle des cellules des parois des vaisseaux sanguins thymiques et de l’axe ligand-X/récepteur-Y dans la régénération thymique. Par ailleurs, notre étude du rôle de l’axe ligand-X /récepteur-Y dans la dissémination leucémique permettra de mettre en avant une nouvelle cible thérapeutique, particulièrement en ciblant cet axe afin de limiter l’invasion dans les tissus. A plus long terme, nos études devraient participer au développement des thérapies promouvant le vieillissement en bonne santé en corrigeant les défauts de développement thymique liés à l’âge et pourrait permettre d’améliorer la prise en charge des patients atteints de leucémies.

Pour l’étude du rôle du ligand-X dans les cellules des parois des vaisseaux sanguins thymiques, des souris âgées de 8 semaines, 12 mois (involution thymique avancée) ou 18 mois (involution thymique très avancée) vigiles recevront 2 séries d’injections (1 injection quotidienne par série de 4 jours, espacée de 3 jours de la suivante) permettant d’éliminer le récepteur Y dans les cellules des parois des vaisseaux sanguins. Trois jours après la dernière injection, les souris âgées de 12 et 18 mois seront traitées avec le ligand-X ou un contrôle par injection sous anesthésie gazeuse légère, 3 injections par animal sur 3 jours consécutifs. Une partie des animaux recevront des progéniteurs de lymphocytes T par injection sous anesthésie gazeuse légère. La fonctionnalité des cellules sera ensuite analysée. Pour le modèle de leucémie, les souris âgées de 8 semaines recevront 2 séries d’injections (1 injection quotidienne par série de 4 jours, espacée de 3 jours de la suivante) permettant d’éliminer le récepteur Y dans les cellules des parois des vaisseaux sanguins. Trois jours après la dernière injection, les animaux recevront une injection de cellules leucémiques sous anesthésie gazeuse légère durant 2 minutes par animal. Aux jours 3 et 6 après l’injection des cellules leucémiques, les animaux seront soumis à un prélèvement de sang sur animaux vigiles. Finalement, pour les tests de réponse vaccinale, des souris de 12 mois seront traitées avec le ligand-X ou un contrôle sous anesthésie gazeuse légère, 3 injections par animal sur 3 jours consécutifs. 28 jours après la première injection, les animaux recevront par voie sous-cutanée une protéine A en tant que modèle de vaccination sous anesthésie gazeuse légère.

Les injections intraveineuses (sous anesthésie gazeuse légère) et intrapéritonéales peuvent générer un stress, un inconfort et une douleur légère de courte durée. Concernant le modèle de leucémies, la maladie peut générer des nuisances caractérisées par un inconfort et une douleur prolongée. Bien que ce modèle puisse être léthal au-delà de 21 jours, les souris seront mises à mort et analysées à un temps court (maximum 10 jours) dans le cadre de ce projet. Les nuisances possibles sont : un stress, une perte de poids et une potentielle douleur prolongée. Concernant le modèle de réponse vaccinale, les injections sous-cutanées (sous anesthésie gazeuse légère) peuvent générer un stress et une douleur légère de courte durée et peuvent éventuellement générer une inflammation locale, qui sera surveillée quotidiennement attentivement. Les nuisances possibles sont : un stress, une perte de poids et une potentielle douleur modérée et prolongée.

Les animaux utilisés seront mis à mort pour l’analyse à la fin des procédures.

A ce jour, aucune alternative non animale permet d’étudier l’effet de la régénération de la production du thymus par le traitement ligand-X. De plus, l’étude de la dissémination leucémique au sein des tissus nécessite l’utilisation du modèle in vivo. Notre projet nécessite donc une approche in vivo afin de mettre en relation les différentes composantes tissulaires et cellulaires impliquées dans la réponse étudiée.

Le choix du nombre d’animaux est réalisé afin de Réduire le nombre d’animaux utilisés tout en garantissant la reproductibilité et la fiabilité des résultats. Il prend en considération la variabilité inter-individuelle, la variabilité de réponse au traitement et la variabilité de charge leucémique. Après la première expérience, le nombre d’animaux à utiliser sera ajusté après estimation du nombre d’animaux nécessaires pour garantir un résultat fiable. D’après nos analyses de la littérature et notre expérience passée, un nombre de 9 à 15 animaux par groupe devraient fournir des résultats suffisamment robustes et interprétables. Afin d’éviter les biais expérimentaux, les animaux seront répartis en aveugle dans les différents groupes de traitement par un expérimentateur tiers. Afin de Réduire le nombre de souris contrôles utilisées, un maximum de groupes différents seront constitués lors d’une même expérience, e.g. l’étude de la dissémination leucémique chez les animaux et l’étude de l’effet d’une neutralisation du ligand-X chez ces animaux.

Afin de Réduire les nuisances, plusieurs mesures seront prises. Concernant le stress de manipulation, les animaux seront manipulés par un seul expérimentateur sauf pour l’étape de répartition dans les groupes. Les animaux seront soumis à une anesthésiés gazeuse légère par inhalation gazeuse avant chaque injection intraveineuse. Les animaux bénéficieront par ailleurs d’une surveillance quotidienne ou tous les deux jours selon la procédure, afin d’identifier tout signe de gêne ou de douleur, à l’aide d’une grille d’évaluation dans le cas de la leucémie. Entre autres, les animaux seront pesés tous les jours avec une balance de précision, et seront soumis à une surveillance accrue dès l’identification d’une perte de poids. En cas de faiblesse pouvant générer un défaut d’alimentation ou de perte de poids importante, une alimentation hydratée spécifique sera déposée dans le fond de la cage. Les signes de douleurs seront monitorés avec précision selon la grille d’évaluation, et des analgésiques seront administrés à l’apparition de signes de douleurs.

La souris est le modèle de choix des divers projets de l’équipe, adapté à l’analyse du système immunitaire, et en particulier du thymus, ainsi qu’à l’oncologie. Les souris génétiquement modifiées que nous utiliserons ont un fond génétique stable et après traitement, le récepteur Y sera spécifiquement mutée dans les cellules des parois des vaisseaux sanguins thymiques . Trois âges sont prévus : -stade jeune : souris de 8 semaines. -stade avancé d’involution thymique : souris âgées de 12 mois. -stade très avancé d’involution thymique : souris âgées de 18 mois.