Identification et caractérisation de molécules ciblant les récepteurs d’aryl hydrocarbone (AHR) chez le rongeur

Récemment, l’étude de cette protéine s’est intensifiée car un dysfonctionnement de l’activité et de l’expression de cette protéine a été retrouvé en cancérologie (glioblastome, cancer du côlon, etc…) et dans les maladies inflammatoires chroniques de l’intestin. Dans ces pathologies, cette protéine est fréquemment sur-exprimé et/ou sur-activé, ce qui fait de cette protéine une cible d’intérêt pour le développement de nouveaux radiotraceurs à visée thérapeutique et/ou diagnostique. In vitro, des tests d’activation et d’inhibition de cette protéine ont permis de sélectionner 10 molécules candidates. Ces molécules ont toutes la spécificité de pouvoir être marquées au fluor 18. Les résultats obtenus sont très encourageants. Il est maintenant nécessaire de les tester sur l’animal vivant (organisme entier) pour valider leur potentielle utilisation à visée diagnostique et/ou thérapeutique. La validation de l’utilisation d’une molécule candidate consiste à démontrer que cette molécule sera un outil performant permettant de quantifier l’expression de cette protéine .

Différentes études ont montré que cette protéine joue un rôle fondamental dans le développement et le fonctionnement de notre organisme. Plusieurs études ont montré que des dysfonctionnements liés à cette protéine étaient impliqués dans des maladies auto-immunes (polyarthrite rhumatoïde, lupus érythémateux), dans des maladies inflammatoires du tube digestif (maladie de Crohn, rectocolite hémorragique…), les pneumopathies obstructives chroniques, ou encore différents types de cancers . Disposer d’un radiotraceur permettant de quantifier cette proteine in vivo serait un atout important pour les patients atteints de ces maladies afin d’aider à l’amélioration de leur prise en charge. De même, de nombreuses équipes de recherche sont en cours de développement de nouvelles stratégies thérapeutiques ciblant cette protéine dans ces maladies. Dans ce contexte, disposer d’un traceur radioactif spécifique de cette protéine permettra de mieux caractériser les mécanismes d’action de ces médicaments et de définir les doses nécessaires à leurs potentiels effets thérapeutiques.

Pour une expérimentation concernant l’injection d’un produit qui durera au total 125min: elle sera réalisée une seule fois sous anesthésie générale (induction, maintien lors de l’injection) pendant 5 min sur des souris, injection dans la veine du pénis ou veine caudale 1 fois pendant 30 secondes. Pour une autre procédure concernant l’injection de 2 produits , d’une durée totale d’environ 150min , les souris auront 2 anesthésies gazeuses pendant 5 min lors de injection en intra-veineux (IV) (induction, maintien lors de l’injection) et injection en intraveineux 2 fois pendant 30 secondes à 20min d’intervalle. Pour l’expérimentation de l’imagerie: les souris auront 5 anesthésies gazeuses durant 130min à la fréquence d’une fois par semaine sur une durée totale de 5 semaines (induction, maintien pendant imagerie de l’animal) , 5 fois une pose de cathéter en intra-veineux, d’environ 10 min et ou 5 fois une injection intrapérionéale pendant 10 secondes et 5 imageries pendant 120min d’une fréquence 1 fois/semaine pendant 5 semaines. Pour la procédure des rats, cette expérimentation durera environ 2h30, elle sera réalisée une seule fois sur l’animal sous anesthésie générale. les animaux seront soumis à une chirugies d’environ 30 minutes pour la mise en place des cathéters à la veine et l’atrère fémoral. les rats seront ensuites imagés pendant 120 min. au cours de l’imagerie , des prélèvements sanguins seront réalisés pendant l’imagerie à 1min, 5 min, 15 min, 30 min, 60 min et 120 min).

La manipulation avant l’anesthésie entraine un léger stress chez l’animal. La contention nécessaire à l’induction de l’anesthésie rajoute une source de stress supplémentaire. Une douleur au point d’injection du radiotraceur ou de l’antagoniste peut-être ressentie jusqu’à la mise à la mort. Un hématome associé à une douleur au niveau de la queue à la pose ou au retrait du cathéter peut apparaitre. Une injection intrapéritonéale peut provoquer de la douleur.

Les animaux seront euthanasiés pour des études ex-vivo

Cette étude in-vivo fait suite à de nombreuses étapes de mise au point et de caractérisation in vitro. La caractérisation in vivo et la validation d’un radiotraceur ne peuvent s’effectuer sans l’utilisation de modèles animaux. En effet, la fixation d’un radiotraceur dans les différents organes d’intérêt, ainsi que le passage de la barrière hémato-encéphalique ne peuvent être modélisés in vitro/in silico. De plus, la fonction d’entrée artérielle ne peut-être substituée par une modélisation mathématique car l’objectif final est d’obtenir la vérité terrain de la distribution systémique et la fixation du radiotraceur au sein de l’organisme entier vivant.

Le nombre d’animaux détaillé dans ce document est maximal est sera revu à la baisse en fonction de la quantité de molécules qui passeront l’étape de biodistribution froide, donc ayant montré une fixation spécifique. Ce projet sur 5 ans pour 10 molécules nécessite l’utilisation de 2 espèces : – 2160 souris sauvages (non transgéniques) et 280 souris transgéniques pour la protéine concernée – 200 rats Wistar. Des tests statistiques seront réalisés à la suite de ces études.

Les animaux seront hébergés en groupe avec présence d’enrichissement (bâton à ronger, papier absorbant, maison ou tube en plastique). Les animaux seront observés une à deux fois par jour. Toutes les stratégies d’analgésie, d’anesthésie et de soin seront mises en œuvre pour Réduire au maximum tout inconfort qui pourrait être induit lors de ce projet. Pendant le protocole, si nous constatons des bagarres dans les cages, nous procéderons à une séparation des individus. En cas de blessures, nous appliquerons un nettoyant et un désinfectant sur la plaie jusqu’à la cicatrisation complète. La posture de l’animal et sa réactivité à des stimuli externes seront monitorés chaque jour. Pendant les expérimentations, l’induction d’anesthésie gazeuse sera réalisée à 3% et les animaux seront maintenus à 2%, une protection oculaire sera appliquée. Si au cours du projet, les animaux présentent des signes de souffrance (poils hérissé, prostration…) la décision de la mise à mort sera prise par une personne habilitée à ce geste. L’animal sera maintenu durant toutes les expérimentations d’imagerie sur tapis chauffant, le rythme respiratoire et la température corporelle seront surveillés. Une grille de score sera utilisée pour évaluer les expressions faciales une fois par semaine, le lendemain des expérimentation d’imagerie. Lors du protocole de la chirurgie, l’induction d’anesthésie sera réalisée en gazeux à 4% et les animaux seront maintenus à 3%, une analgésie sera injectée durant tout la chirurgie et un anesthésique local sera appliqué au niveau du site d’incision. Une protection oculaire sera également appliquée. Durant cette manipulation, l’animal sera maintenu sur un tapis chauffant, le rythme respiratoire et la température corporelle seront surveillés.

Le seul moyen de s’assurer de la spécificité d’un radiotraceur envers sa cible est d’utiliser des animaux qui n’expriment pas cette cible, soit des animaux transgéniques (souris) pour le gène désiré. En revanche pour la fonction d’entrée artérielle, dont le but est de caractériser la pharmacocinétique du radiotraceur, le rat sera utilisé car cette procédure n’est pas à l’heure actuelle réalisable chez la souris. Nous utiliserons des souris adultes afin d’avoir une taille de cerveau compatible avec la technique d’imagerie utilisée dans ce protocole et des rats adultes qui ont la taille adaptée pour la réalisation de la chirurgie.