Rôle de l’activateur tissulaire du plasminogène au cours de l’allaitement et son importance au cours du développement post-natal.

Des études chez l’Homme mettent en évidence une expression variable des protéines du système d’activation du plasminogène (tel que l’activateur tissulaire du plasminogène) dans le lait maternel selon que la naissance des enfants ait lieu prématurément ou à terme. Ces protéines sont connues pour être exprimées dans certaines cellules du système nerveux central et peuvent jouer un rôle important dans le neurodéveloppement. Par exemple, elles peuvent jouer un rôle important dans la mise en place du cortex cérébral. Notamment, l’absence de l’activateur tissulaire du plasminogène au cours du développement entraine des altérations de la compaction de la gaine de myéline qui entoure les neurones, sous-jacents à des troubles moteurs et cognitifs. Ainsi, l’objectif de ce projet est de caractériser le rôle de cette protéine présente dans le lait maternel, au cours de l’allaitement, sur le développement cérébral post natal. Pour ce faire, des souriceaux déficients en activateur tissulaire du plasminogèneseront adoptés et élevés dès leur naissance (jour post natal 0 ; P0) par une mère ayant conservé le gène codant la protéine. De la même façon, nous utiliserons également des souriceaux nés d’une mère exprimant l’activateur tissulaire du plasminogène, élevés par une mère déficiente en cette protéine. Deux groupes de souriceaux contrôles seront également utilisés : un groupe de souriceaux exprimant l’activateur tissulaire du plasminogène et un groupe ne l’exprimant pas resteront avec leur mère biologique respectives. Des analyses comportementales, en imagerie par résonnance magnétique anatomique ainsi qu’en imagerie fonctionnelle échographique seront réalisées à plusieurs stades de développement post-natal, jusqu’à l’âge adulte. Des études transcriptomiques et protéiques seront également conduites à partir de prélèvements de tissus.

D’un point de vue scientifique, cette étude va nous permettre d’acquérir des données fondamentales pour mieux comprendre l’influence de la composition du lait maternel sur le développement cérébral. Les procédures expérimentales ont un caractère de stricte nécessité et ne peuvent pas être remplacées par d’autres méthodes expérimentales n’impliquant pas l’utilisation d’animaux vivants et susceptibles d’apporter le même niveau d’information. En effet, l’étude du rôle des protéines du système d’activation du plasminogène doit se faire au cours de la phase d’allaitement sur des souriceaux in vivo, afin d’observer leur trajectoire neurodéveloppementale, d’un point de vue fonctionnel et morphologique.

L’anatomie du système nerveux central sera observée en imagerie par résonance magnétique (50 minutes maximum, n = 720) et en imagerie fonctionnelle échograpghique (1 heure maximum, n = 720) aux jours post-nataux (P) 7, 10, 15, 21, 30 et 60. Cette dernière technique nécessitera l’administration d’un agent de contraste par voie intra veineuse. La méthode la plus efficiente pour cette administration jusqu’à P30 est en intracardiaque, sous anesthésie (n=600), et par pose d’un cathéter sur la veine caudale de la queue à P60 (n=120). Une procédures chirurgicale d’une durée de 45 minutes sera réalisée afin de poser des prothèses de contention qui permettront d’éviter les artéfacts mouvements de la tête lors des acquisitions en imagerie (n = 720). Le développement des capacités sensorimotrices, cognitives et émotionnelles sera également évalué, de manière longitudinale à P7, P10, P15, P21, P30 et P60 (n = 600). 960 souriceaux serviront uniquement à prélever des tissus à P7, P10, P15, P21, P30 et P60. Les 750 gestantes ne subiront aucune intervention et la seule nuisance qu’elle pourraient recevoir serait liée à un éventuel stress lors de la séparation avec leur souriceaux lors des évaluations comportementale de ces derniers.

Les nuisances et effets indésirables étant susceptibles d’apparaître chez les animaux seraient : Pour toutes les procédures : une perte de poids, des douleurs post-opératoires, du stress, des déficits fonctionnels et/ou cognitifs. Tous les animaux auront un suivi attentif et régulier par l’expérimentateur et le personnel animalier qualifié (prise journalière du poids des animaux, observation des animaux dans la cage en s’assurant de leur bien-être (grimace scale, prise alimentaire et boisson).

L’ensemble des animaux utilisés dans ce projet feront l’objet d’une mise à mort à la fin de chaque procédure afin de générer des tissus permettant des observations histologiques.

Les procédures expérimentales pour réaliser ce projet ont un caractère de stricte nécessité et ne peuvent pas être remplacées par d’autres méthodes expérimentales n’impliquant pas l’utilisation d’animaux vivants et susceptibles d’apporter le même niveau d’information. De plus, nous disposons au laboratoire d’une souche de souris très bien caractérisée, qui sont déficientes en activateur tissualire du plasminogène, ce qui en fait le modèle le plus adapté à ce projet. Les conditions d’élevage, d’hébergement, de soin et les méthodes utilisées sont les plus appropriées pour respecter le bien-être de l’animal. Le projet est justifié d’un point de vue scientifique car il permettra des recherches fondamentales, translationnelles et/ou appliquées pour le diagnostic et le traitement de différentes pathologies neurodéveloppementales humaines.

Notre projet ne nous permet pas d’utiliser d’autres moyens que l’expérimentation animale. Avant de procéder à une telle étude, nous nous sommes assurés d’utiliser le nombre minimal d’animaux adéquat pour atteindre le résultat souhaité. Ainsi, les procédures expérimentales décrites dans ce projet ont un caractère de stricte nécessité et ne peuvent pas être remplacées par d’autres méthodes expérimentales n’impliquant pas l’utilisation d’animaux vivants et susceptibles d’apporter le même niveau d’information disponible. Dans chaque phase du projet, le minimum d’animaux a été prévu afin d’arriver à des résultats qui soient en adéquation avec ceux prévus lors de ce projet. Le nombre d’animaux pour chaque étude a été défini à partir de l’expertise au sein du laboratoire et des données de la littérature. De plus, afin de ne pas biaiser les résultats, les analyses comportementales ne seront pas suivi d’analyses morphologiques afin d’éviter les effets de la récupération fonctionnelle en réponse à la plasticité cérébrale. Dans la même idée, aucune évaluation comportementale ou histolgique ne sera réalisé consécutivement aux imageries qui nécessitent une anesthésie générale. En effet, des travaux récents mettent en évidence que l’anesthésie agit sur l’intégrité cérébrale, surtout lorsqu’elle est pratiquée précocement au cours du développement. Ce point limitera l’utilisation d’animaux pour des expériences qui ne marcheraient pas. Enfin, l’effet sexe sera observé, ce qui permettra de limiter l’utilisation d’animaux pour des résultats qui seraient biaisés par ce paramètre.

Afin de souscrire au principe de Raffinement, les animaux seront anesthésiés et analgésiés avant, pendant et après chaque procédure le nécessitant. Au cours de l’intervention chirurgicale, les paramètres vitaux de l’animal seront surveillés et optimisés tout au long de la procédure. Les yeux des souris seront couverts de gel oculaire afin de ne pas les éblouir avec la lampe de la loupe binoculaire et prévenir de la déshydratation.

La souris est l’espèce animale la plus étudiée dans le domaine du développement et les techniques employées sont bien connues. L’anatomie du système nerveux murin et la physiologie de la souris sont également bien connues et sont proches de celles de l’Homme. Par ailleurs, l’utilisation des souris comme modèle d’étude permet l’utilisation de nombreuses souches génétiquement modifiées disponibles au laboratoire comme celles déficientes en activateur tissulaire du plasminogène. Ces éléments positionnent alors ce modèle comme le plus en adéquation avec le projet. L’ensemble des connaissances et des acquis dont nous disposons au sein de l’unité et dans la littérature rend cette espèce particulièrement intéressante pour cette étude. Les procédures sont basées sur l’étude du neurodéveloppement post-natal, il est donc nécessaire de se procurer des femelles allaitantes avec leurs souriceaux. Le stade de développement de ces femelles est de 2 à 5 mois car nous devons attendre leur maturité sexuelle. De plus, au cours du développement physiologique et pathologique chez la souris, les changements fonctionnels, morphologiques, comme les processus cellulaires et moléculaires en jeu s’opère très rapidement. De ce fait, une analyse à de nombreux stades de développement (P7 / P10 / P15 / P21 / P30 / P60) est nécessaire afin d’identifier des différences significatives dans la trajectoire développementale des différents groupes.