Résumé non technique d'un projet d'expérimentation animale, reproduit depuis ALURES
("EC NTS/RA identifier" : NTS-FR-952834)
Objectifs et bénéfices escomptés du projet
Décrire les objectifs du projet.
Ce projet s’inscrit dans le cadre d’un programme de recherche destiné à identifier de nouvelles molécules permettant de traiter la cirrhose à stade très avancé ou une ACLF (acronyme d’Acute on Chronique liver Failure ou décompensation aiguë de la cirrhose) La cirrhose se définit par l’accumulation excessive de fibrose conduisant à la dégénérescence du foie.
Quels sont les bénéfices susceptibles de découler de ce projet?
Le pronostic des patients cirrhotiques est variable en fonction de la cause et de son contrôle et de la présence de décompensations. L’ascite réfractaire survient chez 5-10 % des patients cirrhotiques, avec un taux de mortalité de plus de 50 % à 2 ans. Souvent, elle s’associe à d’autres complications comme l’infection spontanée du liquide d’ascite. Lors de la phase terminale de cette décompensation et suivant la qualité de vie du patient, l’espérance de survie en dehors d’une transplantation hépatique n’est que de quelques mois. Dans le cadre de l’ACLF, il est nécessaire de prendre en charge les patients pour des défaillances multiples et de préserver le capitale hépatocitaire des patients. La perte de fonctionnalité du foie durant cette période conduit à un décès du patient de façon précoce. Les traitements actuels sont purement symptomatiques et ne visent qu’à limiter les risques liés à l’hypertension portale, les surinfections, les risques d’hémorragie ou au contraire de thrombose et sont proposés au cas par cas, ce de manière à préserver les chances d’éligibilité à la transplantation. Les solutions thérapeutiques que nous espérons développer visent à agir sur les différents mécanismes conduisant à une réfractarité de l’ascite, la perméabilité de la paroi intestinale et les productions d’ammoniaque à l’origine de l’encéphalopathie pour la décompensation traditionnelle. Elles visent à agir sur les différentes voies à l’origine de la défaillance multiple (inflammation, immunitaire, métabolique et vasculaire) dans le cadre de l’ACLF.
Nuisances prévues
À quelles procédures les animaux seront-ils soumis en règle générale?
Période d’induction : Décompensation spontanée selon les procédures : Jusqu’à 44 administrations par gavage ou par administration intrapéritonéale de composé chimique hépatotoxique, à raison de 2 fois par semaines pendant 22 semaines (15 secondes) ou jusqu’à 44 administrations par administration intrapéritonéale de composé chimique hépatotoxique à raison de 2 fois par semaines pendant 22 semaines (15 secondes). Sur les procédures de caractérisation de chacun des agents inducteurs (procédure 1 et 2), les animaux pourront subir jusqu’à 6 prélèvements de sang à la veine sublinguale intermédiaire (1 minute) sous anesthésie (3minutes). En dehors de ces deux procédures, les animaux subiront un prélèvement de sang intermédiaire à la veine sublinguale intermédiaire (1 minute) sous anesthésie (3minutes). Pour les études de type ACLF, les animaux subiront une administration intrapéritonéale, par voie intraveineuse ou par gavage des agents inducteurs (15 secondes). Pour les études avec test de composés, en dehors de la phase d’induction de la cirrhose et de l’ACLF, les animaux pourront subir jusqu’à 10 administrations par gavage, voie intrapéritonéale ou intraveineuse (15 secondes). Dans certains cas, les 4 administrations avec un volume plus important en intrapéritonéale se fera sous anesthésie (durée 1 minute), avec 4 drainages du dialysat à raison d’une fois par jour (15 minutes) sous anesthésie générale. L’administration intraveineuse pourra être faite par infusion lente à l’aide d’un perfuseur (durée 120 minutes).
Quels sont les effets/effets indésirables prévus sur les animaux et la durée de ces effets?
L’induction de la fibrose n’induit pas de douleur mais un inconfort et un stress passager lié à la contention nécessaire pour le gavage ou l’administration intrapéritonéale des agents, l’habituation au geste estompe rapidement ce stress. La gêne est présente mais pas accompagnée d’une analgésie chez l’humain. Les animaux présentant de l’ascite semblent présenter des signes de gêne de posture lorsque celle-ci est abondante sans pour autant présenter des signes de douleurs (grimace scale). L’administration massive d’alcool produisent les effets d’une ivresse importante (perte d’équilibre, ataxie). L’ACLF est un épisode grave chez le patient dont le pronostic vital est engagé. Le modèle animal présente, par voie de conséquence, lors de l’induction de l’ACLF des signes d’inconfort manifestes. L’administration unique ou répétée des agents inflammatoires ont des effets notoires sur les animaux dans les heures qui suivent les inductions. On s’attend à observer des animaux en état de choc et de détresse cardio-respiratoire, avec des épisodes de troubles de la régulation de la température corporelle. Les effets cités sont observés de manière plus ou moins prononcée, ces signes constituent les critères d’atteinte des points limites. Certains animaux présenteront ces symptômes à des stades qui nécessiteront un point d’arrêt anticipé. Dans les situations d’études de survie où le délai jusqu’à la mort est une donnée clé de la procédure, le recours au point d’arrêt anticipé sera appliqué et c’est à ce moment précis que sera déclarée la mort de l’animal. Pour évaluer les effets de nos composés, nous nous fixons comme objectif de reproduire une gravité qui sera jugée sévère mais qui permette de maintenir des animaux dans un état acceptable du point de vue éthique et conservant toute pertinence scientifique.
Justifier le sort prévu des animaux à l’issue de la procédure.
L’intégralité des animaux sera mis à mort à l’issue des procédure afin de pouvoir étudier les biomarqueurs circulant, histologique ou transcriptionnelle permettant de caractériser la pathologie et l’efficacité d’une molécule.
Application de la règle des "3R"
1. Remplacement
La possibilité de disposer d’un modèle animal qui permet d’évaluer les effets des nouveaux composés sur tous les aspects d’une pathologie présente chez l’homme constitue une étape clé dans la lutte contre ces maladies et font de nos modèles des outils translationnels très pertinents. Bien qu’une première phase de sélection des meilleurs composés soit effectuée sur des modèles acellulaires ou cellulaires, contribuant ainsi à l’utilisation de méthodes alternatives visant à Remplacer partiellement l’utilisation des animaux comme nous le rappelle la règle des 3R’s, l’évaluation finale du potentiel thérapeutique des produits dans des modèles animaux reste cependant nécessaire. Les pathologies étudiées étant multi-organes, le recours à l’emploi d’un animal vivant permet d’évaluer la réelle efficacité des composés dans un système biologique complexe et « global », capable de métaboliser les principes actifs donc de déceler les effets secondaires, capable d’activer toutes les voies de signalisation qui participent à la caractérisation de ce modèle. Son Remplacement à ce stade du projet scientifique (phase pré clinique) n’est pas envisageable dans un système biologique isolé ou cellulaire qui quel que soit sa nature ne pourra apporter tous les enseignements issus de l’expérimentation in vivo.
2. Réduction
La stratégie de Réduction consiste à ne réaliser que les essais avec les composés les plus prometteurs ayant satisfait aux étapes de sélection préliminaires in vitro. La Réduction du nombre d’animaux est motivée par la longueur/lourdeur des procédures expérimentales, cela nous a conduit lors d’essais pilotes ou préliminaires de cibler le juste nombre d’individus nécessaires à l’obtention de résultats pertinents. Les paramètres que nous étudions in vivo (bio marqueurs, induction/répression de gènes, effets histologiques etc) doivent être relevant. Ces études pilotes nous permettront de caractériser et d’écarter les paramètres dont la pertinence serait trop faible pour être statistiquement décelable qu’avec des effectifs trop importants. Nous disposons de données expérimentales ou publiées dans la littérature sur les paramètres biologiques ou biomarqueurs les plus pertinents et « robustes ». La connaissance de la variance de ces biomarqueurs permet de définir un effectif théorique à l’aide d’un test statistique qui associe variance et probabilité d’atteinte d’un seuil de significativité. Cette approche statistique permet d’affiner les effectifs et de Réduire donc les nombres d’animaux qui seraient surévalués et non nécessaires à l’obtention d’un résultat biologique relevant. Une priorité sur le développement sera accès par rapport à la prépondérance observée chez l’homme : infection (LPS), consommation excessive d’alcool et/ou intoxication médicamenteuse (APAP), le développement des autres agents précipitants sera envisagé qu’au cas où ceux-ci ne donneraient pas les résultats escomptés. Dans le cas d’administrations de composés par voie veineuse en aigue ou en répétés, peuvent se présenter des difficultés techniques et nous oblige parfois à augmenter les effectifs de façon à combler les pertes.
3. Raffinement
Les rats sont hébergés par paire, l’enrichissement du milieu est systématisé par l’apport de dispositifs permettant aux animaux de rongeur (blocs ou billes des bois), un apport de coton compressé permet de maintenir l’instinct de création du nid, des tunnels en polycarbonate transparent teintés en rouge sont placés dans les cages pour apporter un espace simulant la dissimulation et favorisant le maintien de l’instinct grégaire des rats. Nous avons opté pour la pose de cathéters qui offrent un accès à l’aide d’un bouton métallique bouché par un obturateur aimanté qui présente l’avantage de pouvoir faire cohabiter les animaux dans une même cage sans crainte d’arrachage du cathéter par les congénères, cela constitue une amélioration significative du bien-être des animaux. L’établissement de points limites dans ce modèle expérimental de défaillance hépatique nous permet d’écarter tout individu susceptible de subir un inconfort trop important ou de la douleur. Bien conscient que nous développons dans ce projet des modèles sévères, nous nous efforçons d’avoir recours à des moyens analgésiques adaptés et non confondants. La pathologie et les mécanismes qui la déclenchent sont en partie connus, l’emballement inflammatoire en est une composante, le recours à des moyens de lutte contre la douleur peut introduire un biais expérimental ; une étape de validation s’impose pour chaque situation.
Expliquer le choix des espèces et les stades de développement y afférents.
Sur la base de la littérature scientifique, aucun modèle invertébré ne permet à ce jour dans le cadre de la cirrhose du foie de valider l’efficacité d’une nouvelle molécule dans le traitement de cette pathologie ou celles qui lui sont associées. Le génome des rongeurs et celui de l’homme ont 90% d’homologie, cela en fait un modèle de choix dans les études pharmacologiques. Le choix de l’espèce rat a été fait en se basant sur la littérature scientifique et sur nos connaissances des caractéristiques des molécules à tester. Pour les études menées sur les rats avec une présensibilisation au phénobarbital et induction au composé hépatotoxique, nous utiliserons des animaux de 4 semaines à l’arrivée (75-100 gr) âge préconisé dans la littérature, c’est en effet lorsque les rats ont atteint un poids de 100gr environ que l’effet du phénobarbital est le plus efficace. L’ensemble des autres études (sans présensibilisation au phénobarbital) sera réalisé sur de jeunes adultes, à savoir 6 à 7 semaines (250 à 300 g) à l’arrivée. Les traitements induits aux animaux affectent essentiellement la fonction hépatique et produisent des modifications métaboliques. Il est nécessaire de les appliquer sur un organisme développé, qui puisse mettre en place des mécanismes de réparation et de défense. L’animal au stade de jeune adulte qui a un système immunitaire compétent (microbiote bien établi) et des mécanismes de réponse à des stress inflammatoires correspond au stade de vie requis pour développer notre modèle expérimental.