Etude des effets d’un anticorps monoclonal bloquant l’interaction de l’activateur tissulaire du plasminogène et du récepteur N-Methyl-D-Aspartate dans des contextes pathologiques de type neurovasculaire ou neurodégénératifs chez la souris.

L’objectif de cette étude est de déterminer la dose efficace d’un anticorps humanisé (LYS241) bloquant l’interaction de l’activateur tissulaire du plasminogène avec les récepteurs N-Methyl-D-Aspartate (NMDAR) dans des modèles de pathologies neurologiques incluant l’accident vasculaire cérébral, la sclérose en plaques et le traumatisme crânien. Ce projet permettra également de comparer cet anticorps avec des molécules approuvées en clinique dans les différentes pathologies étudiées dans ce projet.

Ce projet a pour but de déterminer la dose efficace d’un anticorps monoclonal humanisé dans différentes pathologies du système nerveux central. Ce projet vise également à développer, à terme, un nouvel agent thérapeutique transposable à l’homme.

A J0, 150 animaux subiront pendant 1h une chirurgie cérébrale, une injection sous-cutanée et une injection i.v. . A J+1, 150 animaux subiront une anesthésie générale pour passer à l’IRM pendant 15 minutes. A J+5, 50 animaux subiront une anesthésie générale de 30 minutes pour passer à l’IRM et recevront une injection intraveineuse. A J+30, 150 animaux recevront une injection sous-cutanée et seront euthanasiés sous anesthésie générale. A J0, 180 animaux subiront pendant 1h une chirurgie cérébrale, une injection sous-cutanée et une injection i.v.. A J+1, 180 animaux subiront une anesthésie générale pour passer à l’IRM pendant 15 minutes. A J+5, 60 animaux subiront une anesthésie générale de 30 minutes pour passer à l’IRM et recevront une injection intraveineuse. A J+30, 180 animaux recevront une injection sous-cutanée et seront euthanasiés sous anesthésie générale. A J0, 80 animaux subiront pendant 30 minutes une chirurgie cérébrale, une injection sous-cutanée et une injection i.v. A J+1, 80 animaux subiront une anesthésie générale pour passer à l’IRM pendant 15 minutes puis une injection sous-cutanée avant euthanasie sous anesthésie générale. A J-1, 100 animaux auront un patch anesthésiant posé sur le dos pendant 1 heure puis recevront 4 injections sous-cutanées. A J0, 100 animaux auront un patch anesthésiant posé sur le dos pendant 1 heure puis recevront un injection intrapéritonéale. A J+2, 100 animaux auront un patch anesthésiant posé sur le dos pendant 1 heure puis recevront un injection intrapéritonéale. A J+3, J+10 et J+17, 100 animaux recevront une injection intrapéritonéale. A J+25, 100 animaux recevront une injection sous-cutanée avant euthanasie sous anesthésie générale. A J0, 100 animaux subiront une chirurgie cérébrale pendant 20 minutes sous anesthésie générale, une injection sous-cutanée et une injection i.v. A J+1, 100 animaux subiront une anesthésie générale pendant 15 minutes pour passer à l’IRM. A J+21, 100 animaux recevront une injection sous-cutanée puis sous anesthésie générale seront euthanasiés.

Selon la procédure, des nuisances ou effets indésirables sont à prévoir sur les animaux. Toutes les douleurs liées à des lésions de la peau des animaux (comme l’insertion d’une aiguille par exemple) seront empêchées par l’utilisation de la lidocaïne en spray ou en crème 5min avant le geste. Ces douleurs seront temporaires et se résorbent sous 48h. Pour les procédures pour lesquelles la douleur est plus importante, nous utiliserons un morphinique en injection sous-cutanée. Enfin, pour les procédures où la chirurgie est estimée la plus sévère, comme la laparo-thoracotomie, sur conseil du vétérinaire affilié à notre laboratoire, un morphinique fort est préconisé. Un morphinique pourrait être utilisé en intra-péritonéal. Le choix se porte sur ce morphinique car il agit en 3-5 minutes et est effectif sur une durée de 20-25 minutes chez la souris, temps suffisant pour effectuer la mise à mort par perfusion intra-cardiaque. Les procédures relatives aux évaluations comportementales ou d’imagerie sont indolores, mais peuvent engendrer un léger stress qui ne perdure pas dans le temps, dû soit à un nouvel environnement soit à l’isolement social. Les animaux retournent à un état basal dès qu’ils sont de retour dans leur cage et leur boxe de stabulation.

Le sort prévu de tous les animaux de toutes les procédures de cette demande d’autorisation de projet est la mise à mort et tissus récupérés.

Les procédures expérimentales ne peuvent pas être remplacées par d’autres méthodes expérimentales n’impliquant pas l’utilisation d’animaux vivants car des techniques de Remplacement ne sont pas susceptibles d’apporter le même niveau d’informations. Nous avons sélectionné les modèles présentant le meilleur compromis entre pertinence scientifique et sensibilité de l’espèce. En amont de l’expérimentation animale, des méthodes alternatives in vitro existantes répondant au mécanisme d’action de la molécule d’étude ont déjà été employées, nous permettant de justifier le passage de l’in vitro à l’in vivo.

Nous utiliserons le nombre minimal d’animaux afin de souscrire au principe de Réduction. Conformément à la règle des 3Rs, le nombre d’animaux nécessaires au projet a été réduit au maximum, en se basant sur la spécificité/sensibilité des méthodes utilisées, selon nos précédents travaux publiés et la littérature. De plus, n’ayant pas d’intérêt pour une étude de l’impact du sexe des animaux dans le contexte proposé et afin de Réduire le nombre d’animaux dans ce projet, uniquement des souris du sexe mâle seront utilisés. 1600 souris seront nécessaires pour réaliser cette étude, comprenant la réalisation de tests comportementaux et d’outils d’imagerie permettant d’évaluer la récupération fonctionnelle et anatomique in vivo du système nerveux central des animaux. Tous les animaux seront sujets à ces explorations complètes dans le but de Réduire significativement le nombre d’animaux utilisés. Bien que chaque animal sera surveillé de près, pendant et après les procédures, peut arriver d’observer une mortalité non attendue ou une l’exclusion d’animaux pour diverses raisons, telles qu’un problème à l’exposition aux agents anesthésiques, une perte de poids trop importante et manque d’appétit de l’animal, d’évènements de dépression respiratoire. Concernant l’approche statistique, nous prévoyons d’employer des tests paramétriques puisque nos échantillons sont indépendants et que nous comparerons, dans la plupart des cas, des groupes entre eux et ce, en fonction de différents temps.

Les principes éthiques et les standards de Raffinement sont utilisés pendant tout le projet. Les animaux seront hébergés dans des cages standards répondant aux normes européennes actuelles (Directive 2010/63/UE). Une importance particulière sera apportée au bien-être des animaux, notamment par l’hébergement en groupes sociaux de 5 ou 6 animaux, l’enrichissement de leur environnement (maison, paillettes coton et papier kraft en quantité pour la fabrication d’un nid). Pour éviter de stresser les animaux, les cages seront isolées de tout bruit extérieur et l’accès à l’eau et à la nourriture sera ad libitum. Les souris sont surveillées quotidiennement par du personnel qualifié et cela pendant toute la durée du projet afin de veiller à leur bien-être. Une attention particulière est accordée à l’état général, à l’évolution de la masse corporelle, ainsi qu’au comportement de chaque animal. Les expériences seront réalisées par du personnel qualifié en respectant les règles de bonnes pratiques de laboratoire pour le respect des animaux, tout en veillant à ne pas dépasser les points limites fixés au préalable tels qu’une perte de poids maximale de 15%, un arrêt de prise alimentaire et de boisson, une absence de réaction aux stimuli extérieurs, une échelle de douleur importante, des signes de douleurs extérieurs et une Réduction importante de l’activité motrice. Afin de souscrire au principe de Raffinement, les animaux seront anesthésiés et sous couverture analgésique adaptée au niveau de sévérité du geste, durant chaque procédure. Enfin, tout sera mis en œuvre pour Réduire l’angoisse, la souffrance et la douleur de chaque animal, pouvant être occasionnées pendant le projet. L’ensemble des connaissances et des acquis dont nous disposons au laboratoire montre que les animaux se déplacent et s’alimentent normalement, prennent bien soin de leur pelage, n’émettent aucun son et ne présentent aucun trouble du comportement lié aux protocoles.

La souris (Mus musculus) est l’espèce animale la plus étudiée dans le domaine des pathologies neurologiques. L’anatomie du système nerveux ainsi que la physiologie de la souris sont également documentées et relativement proches de ceux de l’Homme. C’est donc via l’utilisation d’approches expérimentales fiables et maitrisées, que la souris représente un bon modèle pour ce projet de recherche. En effet, l’ensemble des connaissances dont nous disposons au laboratoire et dans la littérature rend cette espèce particulièrement adéquate à cette étude. Tous les animaux utilisés pour les expériences de cette demande de projet seront âgés entre 8 et 12 semaines. Ces âges ont été retenus car considérés comme âge « jeunes adultes », l’âge le plus couramment utilisé dans la littérature.