Évaluation d’un traitement in vivo chez la souris modèle du Syndrome de Rett like

Le syndrome de Rett (RTT) est une maladie rare neurodéveloppementale d’origine génétique liée au chromosome X. Elle conduit à une déficience intellectuelle progressive et sévère majoritairement chez les filles. Dans 95% des cas le RTT est dû à une mutation du gène MECP2. Le RTT ne connait à ce jour aucun traitement curatif. Les traitements administrés ciblent les symptômes et complications liées à la maladie afin de les alléger et ainsi améliorer la vie des patientes. Parmi les symptômes on retrouve notamment une perte des fonctions motrices volontaires, des troubles de la respiration et des troubles divers affectant le sommeil et l’alimentation. En 2007, la preuve de concept selon laquelle il est possible de restaurer un phénotype sain (c’est-à-dire que la souris malade est guérie) chez la souris mâle déficiente pour Mecp2 même à un stade avancé de la pathologie est publiée. Cette avancée est porteuse d’espoir et laisse place à de nombreuses études notamment en thérapie génique de Remplacement visant à intégrer dans les cellules une copie saine du gène via un virus modifié. La cible étant le système nerveux central, les études se heurtent à un obstacle majeur : le passage de la barrière hémato-encéphalique présente autour du système nerveux central pour le protéger contre les substances étrangères. Jusqu’ici le virus le plus adapté pour infecter mène à un taux d’infection des cellules assez faible et plusieurs études utilisant ce virus rapportent également une forte expression du gène apporté dans le foie causant une toxicité. Récemment, une publication a montré le potentiel d’un nouveau virus conçu de manière à avoir une forte infection dans le système nerveux central mais pas ailleurs. Ces caractéristiques pourraient résoudre les effets secondaires observé avec le précédent virus. L’objectif de l’étude est de caractériser ce virus appelé AAV.Cap-B10 dans le cadre d’un traitement par thérapie génique sur des souris mâles Mecp2 et femelles déficientes et d’évaluer l’efficacité et la toxicité du traitement.

Ce projet a pour but d’évaluer l’efficacité d’un nouveau virus capable de cibler spécifiquement le système nerveux central sans infecter les autres organes dans le cadre d’une thérapie génique d’une pathologie neuronale. Si l’infection s’avère spécifique et homogène les résultats pourront servir à d’autres équipes cherchant à infecter le système nerveux central dans d’autres pathologies du cerveau. De plus, si le traitement est efficace les résultats serviront de bases pour une étude sur le modèle femelle Rett, étape indispensable avant le passage en essai clinique chez les patientes.

Les animaux seront soumis à: – une biopsie pour identification et classement des animaux (une dizaine de secondes – 1 fois) – déclaration de la maladie (troubles respiratoires, moteurs; stress et perte de poids) – une anesthésie générale gazeuse au cours de laquelle sera réalisée l’injection pour la thérapie génique (durée environ 10min – 1 fois) – des tests comportementaux non invasifs (durée variable selon les tests de 5minutes à 48h – 1 à 3 fois par tests selon les groupes) – une administration par voie orale par gavage (30s à 1 minute) – une anesthésie générale profonde pour la mise à mort (durée 30min – 1 fois) – ponction cardiaque (1 fois 1min au décès) – perfusion intracardiaque (1 fois 1min au décès)

Dans ce modèle de souris, les mâles et les femelles déclarent plusieurs symptômes mimant ceux présents dans le syndrome de Rett. Les mâles montrent une apparition sévère des symptômes de manière précoce (environ 30 jours après la naissance). Chez les femelles les symptômes apparaissent plus tardivement (vers 5mois) et sont moins sévères, la souris est progressivement atteinte. Les effets cliniques attendus chez ces souris sont sévères et comprennent : – une altération des fonctions respiratoires conduisant à des apnées ou de l’hyperventilation – une altération des fonctions motrices conduisant à une Réduction de la mobilité – une sensibilité accrue au stress et une perte de poids seulement chez les mâles (les femelles présentent à l’inverse une prise de poids). Les nuisances générées par les procédures comprennent : – le stress léger lié à la réalisation d’une anesthésie générale gazeuse – le stress léger lié aux tests comportementaux non invasifs – la douleur modérée, de courte durée, modulée par une anesthésie et analgésie adaptée) liée au prélèvement intracardiaque et à la perfusion intracardiaque terminale.

Certains animaux seront gardés en vie comme reproducteurs. Les autres animaux seront mis à mort à l’issue des procédures expérimentales pour prélèvements d’organes.

La pathologie nécessite l’étude du cerveau et se caractérise par un polyhandicap. Pour l’étudier sous toutes ses dimensions un modèle de culture cellulaire n’est pas envisageable. Il est donc nécessaire d’avoir recours à un modèle animal de la pathologie pour espérer produire des résultats qui seront transférables chez l’homme. L’expérimentation sur l’animal permettra d’acquérir le recul et les compétences requises à une recherche translationnelle.

La variabilité interindividuelle est réduite par l’utilisation de souches murines fixées génétiquement. Le nombre d’animaux a été déterminé en se basant sur nos études précédentes et sur le calcul statistique de puissance avec GPower pour répondre à la question expérimentale de façon que les effets attendus puissent être détectés avec un niveau de significativité suffisant tout en garantissant la sécurité des résultats. Cependant, nous utilisons un nouveau vecteur et une nouvelle construction. De ce fait, les effets attendus pourraient ne pas correspondre à ceux émis pour effectuer le calcul de puissance. C’est pourquoi, les expérimentations seront initialement réalisées sur la moitié du n prévu. Les données obtenues feront l’objet d’une analyse statistique préliminaire (étude pilote) en fonction du résultat : – les expérimentations seront arrêtées si aucune différence ne ressort entre les groupes – le nombre d’animaux par groupe sera augmenté si une différence entre les groupes semble exister mais ne ressort pas suffisamment pour atteindre la significativité. Enfin, les expérimentations post-mortem seront réalisées sur un demi- cerveau au lieu d’un cerveau entier (certaines expériences nécessitant des tranches et d’autres le broyage), permettant de Réduire de moitié le nombre d’animaux nécessaires pour ces expérimentations.

L’hébergement est adapté aux besoins physiques et physiologiques des animaux et permet l’expression de leur gamme normale de comportements. Les souris sont hébergées en groupe, dans des cages enrichies (litière, dôme et bandelettes en carton) avec nourriture et eau ad libitum, dans des conditions environnementales maitrisées et conformes à la réglementation. Les souris étant particulièrement sujettes au stress, la manipulation des animaux et le change des cages seront faits par des personnes compétentes et sensibilisées à la contention low stress (cupping et tunnels) et à la fragilité de la lignée. Une période d’habituation à l’expérimentateur et aux tests de comportements est prévue le cas échéant. Les animaux seront anesthésiés pour toutes les procédures expérimentales induisant de la douleur, ici les injections des vecteurs viraux et des microbulles de gaz inerte via la voie rétro-orbitale le cas échéant. Cette anesthésie, sous forme gazeuse (isoflurane), suit les protocoles standards et sera accompagnée d’une analgésie et d’un suivi post-opératoire approprié. Des points limites clairs sont définis et évalués via une grille de suivi du phénotype des animaux afin de mettre en place les soins adaptés le plus précocement possible (antiseptiques, antalgique, anti inflammatoire). En parallèle, l’état général de nos animaux ainsi que l’état de la cage, de la nourriture et de l’eau seront surveillés quotidiennement. Des périodes d’habituation avec les expérimentateurs et pour les tests comportementaux le cas échéants sont prévues afin de diminuer le stress de nos animaux.

La souris permet actuellement de disposer facilement et rapidement d’un modèle mammifère de maladie génétique par manipulation du génome. L’intérêt général du modèle souris, utilisé comme modèle pré-clinique, repose essentiellement sur la proximité physiopathologique avec l’espèce humaine (transférabilité des résultats), un élément nécessaire à une recherche translationnelle valide. Le modèle Mecp2-deficient est le modèle le plus largement utilisé par les laboratoires de recherche dans les études sur le Syndrome de Rett. Il est largement caractérisé dans la littérature ce qui permet une bonne compréhension des animaux. Les souris seront incluses dans les procédures 2 et 3 à 30 jours post-natal (P30). Période à laquelle apparaissent les premiers symptômes chez les mâles et donc est plus proche de ce qui se passerait chez l’homme. L’apparition des premiers symptômes étant nécessaire au diagnostic de la pathologie. Les femelles et mâles utilisés pour la reproduction seront mis en procédure 1 durant la période de fertilité optimale respectivement de 2 à 8 mois et de 2 mois à 1 an post-natal afin d’obtenir des mâles et des femelles malades nécessaires à l’étude. Les deux premiers mois correspondent au temps d’acquisition de la maturité sexuelle.